紫杉奇芬在作为鉴别密叶红豆杉雌雄幼苗的代谢标志物上的应用制造技术

本发明专利技术提供一种紫杉奇芬在作为鉴别密叶红豆杉雌雄幼苗的代谢标志物上的应用。通过色谱结合UPLC

【技术实现步骤摘要】
紫杉奇芬在作为鉴别密叶红豆杉雌雄幼苗的代谢标志物上的应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及紫杉奇芬在作为鉴别密叶红豆杉雌雄幼苗的代谢标志物上的应用。

技术介绍

[0002]红豆杉为红豆杉科红豆杉属乔本植物，原产于喜马拉雅和亚洲东南部部分地区。作为药用植物，红豆杉是远古第四纪冰川时期遗留下来的56种濒危物种植物中，最为珍稀的一种。目前，中国已将其列入国家一级珍稀濒危植物保护范围。红豆杉属植物在全世界有至少15种，我国有4种加一个变种。红豆杉可适应的生长环境较广，包括山地、温带、暖温带和热带的山麓，以及高山、山地、森林，如落叶林、常绿林或混合林等。于全球范围内，红豆杉的海拔分布大致在900～3700m这一区间。
[0003]中国红豆杉含有紫杉醇。据统计的临床实验结果表明，紫杉醇对多种癌症亦有显著疗效，总有效率达75％以上，主要用于治疗晚期乳腺癌、肺癌、卵巢癌及头颈部癌、软组织癌和消化道癌，被称为“晚期癌症的最后一道防线”，被认为是近十年来发现的一种最有希望的抗癌药物。截至目前，已有英、法、日、意大利、加拿大、瑞典、德国、挪威、瑞士、巴西、中国等多个国家获准紫杉醇用于临床治疗。近来还研究发现紫杉醇对类风湿性关节炎、老年性痴呆症等都有很好的疗效。中国红豆杉树形美观大方，四季常青，果实成熟期红绿相映的颜色搭配令人陶醉，可广泛应用于水土保持、园艺观赏等方面，是新世纪改善生态环境，建设秀美山川的优良树种，现常用于高档的庭院绿化观赏。
[0004]密叶红豆杉，又名喜马拉雅密叶红豆杉，生长于海拔2500～3400m的地带，雌雄异株，为喜马拉雅地区特有的红豆杉属植物。密叶红豆杉对生长环境要求相对苛刻，属于小生境物种，具有重要的生态和经济价值，为国家一级重点保护植物。由于该属植物所含的紫杉醇对癌症有良好的疗效，对糖尿病、冠心病等有一定的疗效，其药用价值已引起国内外专家的广泛关注，具有可观的应用前景。但我国的天然密叶红豆杉生境狭窄，濒临灭绝，迫切需要有效的保护和管理措施。目前，针对密叶亚红豆杉的研究已经取得了初步的进展，但其雌雄幼苗在形态学上高度相似，且都含有一定量的紫杉醇，这给两者的区分鉴别工作带来了一定的困难。因此，对密叶红豆杉雌雄幼苗进行准确、快速的鉴别与区分，为推广高效主栽品种、大规模进行有效成分生产以及可持续地开展野生红豆杉资源保护提供了条件。
[0005]非靶向代谢组学(Untargeted metabolomics)是指采用LC
‑
MS、GC
‑
MS、NMR等技术，无偏向性地检测细胞、组织、器官或者生物体内受到干扰前后的全部小分子代谢物(主要是相对分子量在1000Da以内的内源性小分子化合物)的动态变化，并通过生信分析筛选出差异代谢物，对差异代谢物进行相关通路分析，揭示产生这一系列变化的生理机制。再收集代谢物的核质比信号，分析代谢轮廓(metabolomic profiling)，从而推定一条特定的代谢途径，以发现具有特征指示作用的代谢物。目前，通过代谢组技术来发现不同生物样本间的代谢标志物，已成为一个新兴的研究热点。但在植物学及相关领域，利用该技术筛选代谢标志
物并用于植物种间鉴定的研究鲜有报道。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是针对现有技术的不足，提供一种用于鉴别密叶红豆杉雌雄幼苗的代谢组标志物——紫杉奇芬，其在密叶红豆杉雌株幼苗中的含量远高于密叶红豆杉的雄株幼苗，这为解决红豆杉育种和造林过程中遇到的珍稀濒危植物的性别鉴定问题提供了很好的技术手段。
[0007]紫杉奇芬作为鉴定密叶红豆杉雌雄幼苗的代谢标志物上的应用，其化学特征如下：其分子式为C
37
H
44
O
13
，分子量为696.74，化学结构式如下所示：
[0008][0009]作为优选，密叶红豆杉雌株幼苗中紫杉奇芬的质量含量是密叶红豆杉雄株幼苗的10
‑
30倍。
[0010]本专利技术的另一个目的是提供上述鉴定密叶红豆杉雌雄株的检测方法，具体是：
[0011]1)密叶红豆杉雌雄幼苗枝条样品研磨后，用体积含量45％
‑
55％的甲醇溶液提取代谢物。
[0012]称取120μL体积含量45％
‑
55％的甲醇溶液，预冷至
‑
20℃后加入到25mg研磨后密叶红豆杉样品，轻轻震荡1min，室温孵育10min，置于
‑
20℃下过夜。4000
×
g离心20min后，上清液于
‑
80℃保存或干燥保存；
[0013]2)将步骤1)提取液上清液进行LC
‑
MS分析，然后根据紫杉奇芬的质量含量判断，若紫杉奇芬的质量含量高于2.1mg/g则为密叶红豆杉雌株，低于0.21mg/g则为密叶红豆杉雄株；
[0014]高效气相色谱条件如下：
[0015]色相系统为：SCIEX UPLC系统；
[0016]色谱柱温度为：35℃；
[0017]色谱柱为：安捷伦酸性丙烯酰胺柱(100mm*2.1mm，1.7μm,Waters，UK)；
[0018]流动相：流动相A为25mM醋酸铵+25mM氨水，流动相B为9:1的IPA:ACN的+0.1％蚁酸；
[0019]流动相梯度为：0
‑
0.5min为95％的流动相B、0.5
‑
9.5min为95％到65％的流动相B、9.5
‑
10.5min为65％
‑
40％的流动相B、10.5
‑
12min为40％
‑
95％的流动相B、12.2
‑
15min为95％的流动相B；
[0020]质谱条件如下：
[0021]高分辨率质谱仪：TripleTOF5600plus型；
[0022]遮蔽气设置为30PSI，离子源Gas1为60PSI，离子源Gas2为60PSI；
[0023]加热温度为650℃；
[0024]对于正离子模式，离子喷射电压分别为5000V，对于负离子模式，离子喷雾电压浮动分别为
‑
4500V；
[0025]质谱数据采集采用IDA模式，TOF质量范围为60
‑
1200Da。
[0026]作为优选，所述密叶红豆杉雌雄株样品均为幼苗。
[0027]本专利技术的又一个目的是提供紫杉奇芬在鉴定密叶红豆杉雌雄幼苗的试剂盒中的应用。
[0028]本专利技术能产生的有益效果：
[0029]1.本专利技术筛选得到了一个鉴别密叶红豆杉雌雄幼苗的代谢物标志物，并提供了其检测方法。本专利技术通过分析密叶红豆杉雌雄幼苗代谢谱，对代谢物的化学成分进行鉴定，筛选显著差异积累代谢物，得到了可用于鉴定密叶红豆杉雌雄幼苗的代谢物标志物。
[0030]2.本专利技术鉴别方法精确度高，灵敏度高，操作程序化，结果准确可靠。<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.紫杉奇芬在作为鉴别密叶红豆杉雌雄幼苗的代谢标志物上的应用，其特征在于所述紫杉奇芬分子式为C
37
H
44
O
13
，分子量为696.74，其化学结构式如下所示：2.如权利要求1所述应用，其特征在于所述密叶红豆杉雌株幼苗中紫杉奇芬的质量含量是曼地亚雄株幼苗的10
‑
30倍。3.一种密叶红豆杉的雌雄株鉴别方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：1)密叶红豆杉雌雄株样品研磨后用甲醇溶液提取代谢物；2)将步骤1)提取液上清液进行LC
‑
MS分析，判断紫杉奇芬的质量含量是否高于2.1mg/g，若是则为密叶红豆杉雌株，若否则为密叶红豆杉雄株；所述紫杉奇芬分子式为C
37
H
44
O
13
，分子量为696.74，其化学结构式如下所示：4.如权利要求3所述方法，其特征在于步骤1)提取代谢物具体过程是：将120μL体积含量为50％甲醇溶液预冷至
‑
20℃后，加入到25mg研磨后密叶红豆杉样品中，震荡1min，室温孵育10min，置于
‑
20℃下过夜，4000
×
g离心20min，取上清液置于
‑
80℃保存或干燥保存。5.如权利要求3所述方法，其特征在于密叶红豆杉雌雄株为幼苗。6.如权利要求3所述方法，其特征在于密叶红豆杉雌雄株样品采用枝条。7.如权利要求3所述方法，其特征在于所述密叶红豆杉雌株幼苗中紫杉奇芬的质量含量是曼地亚雄株幼苗的10
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈晨佳，侯凯琳，张洪山，梁雪霜，冯尚国，王慧中，
申请(专利权)人：杭州师范大学，
类型：发明
国别省市：