本发明专利技术涉及一种利用红细胞内源性过氧化物酶定量检测ABO血型抗原的方法，属于生物检测技术领域。此方法为将待分型红细胞分别添加至包被有抗A抗体的容器和包被有抗B抗体的容器中进行离心后，洗涤去除没有吸附的红细胞，加入过氧化物酶底物，利用红细胞内源性过氧化物酶显色，加终止液终止反应，在一定波长的滤光片下用酶标仪检测吸光度值，根据OD值的大小判断待分型红细胞的ABO血型抗原；此方法易于自动化操作且稳定性高，此方法包被抗体用量少、样本红细胞经稀释后也是微量，反应结果可以通过酶标仪进行定量，灵敏度高且特异性强。灵敏度高且特异性强。灵敏度高且特异性强。
【技术实现步骤摘要】
利用红细胞内源性过氧化物酶定量检测ABO血型抗原的方法
[0001]本专利技术涉及一种利用红细胞内源性过氧化物酶定量检测ABO血型抗原的方法，属于生物检测领域。
技术介绍
[0002]ABO血型可以分为A型、B型、O型和AB型，是经典的人类遗传标记，在输血、亲子鉴定、人类学研究、法医物证检验等领域均占据重要地位，其中，临床输血中ABO血型分型的意义最为重要，属于临床输血前检查的必查项目。
[0003]ABO血型分型可分正定型和反定型。正定型是用抗A和抗B抗体去鉴定被检者红细胞上有没有相应的抗原，反定型是用A型红细胞和B型红细胞去鉴定被检者血清（血浆）中有无相应的抗体。根据正反定型结果，判断被检者ABO系统的血型。
[0004]目前，通用的ABO血型分型方法有玻片法（纸片法）、试管法、微板凝集法、微柱凝胶法等方法（玻片法、试管法、微板凝集法、微柱凝胶法均记载于《全国临床检验操作规程》中）。但是，这些方法均存在缺陷，例如：玻片法和试管法需要人工操作，费时费力，还容易产生人为误差；微板凝集法抗体和红细胞的加样量和抗体批间差异会影响结果的稳定性；微柱凝胶法在运输过程中试剂凝胶容易变形和产生气泡，影响检测结果。
[0005]CN113092792A公开了一种检测ABO血型抗原的方法、系统及其应用，该方法基于固相吸附法检测ABO血型抗原的正定型方法，此方法为将待分型红细胞分别添加至包被有抗A抗体的容器和包被有抗B抗体的容器中进行离心后，观察待分型红细胞在包被有抗A抗体的容器和包被有抗B抗体的容器底部的吸附情况，根据吸附情况判断待分型红细胞的ABO血型抗原；此方法避免了人工操作，易于自动化操作且稳定性高，此方法包被抗体用量少、样本红细胞经稀释后也是微量，反应结果清晰宜读，灵敏度高且特异性强，并且，此方法摆脱对价格较高的凝胶的依赖，两个微孔和微量抗体与样本红细胞就可以鉴定一个样本红细胞的血型抗原，成本低。但该方法通过肉眼或CCD照相来判定吸附情况，不能给出确切的数值，人工判读存在主观因素，通过CCD机器判读也可能产生误差，只能定性，无法定量。
技术实现思路
[0006]本专利技术的目的在于克服上述不足，提供了一种利用红细胞内源性过氧化物酶定量检测ABO血型抗原的方法，具有易于自动化操作，且有效降低检测成本的优势，将传统的血型定性检测提升为定量检测，OD值的大小间接反映红细胞上该抗原的多少，有助于临床对红细胞亚型的鉴别。
[0007]一种利用红细胞内源性过氧化物酶定量检测ABO血型抗原的方法，所述方法包含分型步骤；所述分型步骤为：将待分型红细胞分别添加至包被有抗A抗体的容器和包被有抗B抗体的容器中进行离心，离心结束后，用生理盐水洗涤微孔板3
‑
6次，最后一次洗涤完成后用吸水纸吸干微孔板中残余液体，加入过氧化物酶底物，利用红细胞内源性过氧化物酶显
色3
‑
20分钟，用酸性溶液终止反应2
‑
10分钟，置酶标仪在特定波长下测定OD值，根据OD值的大小判定被检样本的血型；若待分型红细胞在包被有抗A抗体的容器和包被有抗B抗体的容器检测OD值均小于Cutoff值，则待分型红细胞的ABO血型为O型；若待分型红细胞仅在包被有抗B抗体的容器检测OD大于Cutoff值，则待分型红细胞的ABO血型为B型；若待分型红细胞仅在包被有抗A抗体的容器检测OD值大于Cutoff值，则待分型红细胞的ABO血型为A型；若待分型红细胞在包被有抗A抗体的容器和包被有抗B抗体的容器检测OD值均大于Cutoff值，则待分型红细胞的ABO血型为AB型。
[0008]进一步的，所述离心的转速为90
‑
360g、时间为1
‑
30min。
[0009]进一步的，所述分型步骤前，还包含稀释步骤；所述稀释步骤为：将待分型红细胞稀释至体积浓度为0.1
‑
1%。
[0010]进一步的，所述稀释步骤为：用Liss（低离子强度溶液）或生理盐水将待分型红细胞稀释至体积浓度为0.1
‑
1%。
[0011]进一步的，所述稀释步骤为：用生理盐水将待分型红细胞洗涤3
‑
5次后，用Liss或生理盐水将待分型红细胞稀释至体积浓度为0.1
‑
1%。
[0012]进一步的，所述待分型红细胞在包被有抗A抗体的容器或包被有抗B抗体的容器中的添加量为10
‑
100μL。
[0013]进一步的，所述包被有抗A抗体的容器的制备方法为：将用缓冲液A稀释好的抗A抗体添加至容器后，于2
‑
8℃包被8
‑
16h，得到经包被的容器；在经包被的容器中加入含有蔗糖、脱脂奶粉、Tween20（吐温
‑
20）的缓冲液B后，于37℃封闭0.5
‑
3h，得到包被有抗A抗体的容器。
[0014]进一步的，所述缓冲液B为pH 6.5
‑
8.5的PBS缓冲液；所述蔗糖在缓冲液B中的质量浓度为1
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10%；所述脱脂奶粉在缓冲液B中的质量浓度为0.1
‑
3%；所述Tween20在缓冲液B中的体积浓度为0.01
‑
0.5%。
[0015]进一步的，所述包被有抗A抗体的容器的制备方法包含如下步骤：包被步骤：用pH 6.5
‑
8.5的PBS缓冲液A（含一定浓度的NaCl）将抗A抗体倍比稀释16
‑
2048倍，得到稀释液；将稀释液添加至容器后，于2
‑
8℃包被8
‑
16h，得到经包被的容器；NaCl的优选浓度为0.3
‑
3 mmol。
[0016]第一次洗板步骤：在经包被的容器中加入pH 6.5
‑
8.5的PBS缓冲液C进行洗涤，重复洗涤1
‑
5次，得到经洗涤的容器；封闭步骤：在经洗涤的容器中加入含PBS缓冲液B后，于37℃封闭0.5
‑
3h，得到经封闭的容器；第二次洗板步骤：在经封闭的容器中加入pH 6.5
‑
8.5的PBS缓冲液C（含一定体积浓度的Tween20）进行洗涤，重复洗涤0
‑
5次，得到包被有抗A抗体的容所述包被有抗B抗体的容器的制备方法为：将抗B抗体添加至容器后，于2
‑
8℃包被8
‑
16h，得到经包被的容器；在经包被的容器中加入含有蔗糖、脱脂奶粉、Tween20的缓冲液B后，于37℃封闭0.5
‑
3h，得到包被有抗B抗体的容器。
[0017]进一步的，所述包被有抗B抗体的容器的制备方法包含如下步骤：包被步骤：用pH 6.5
‑
8.5的PBS缓冲液A（含一定浓度的NaCl）将抗B抗体倍比稀释16
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2048倍，得到稀释液；将稀释液添加至容器后，于2
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【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种利用红细胞内源性过氧化物酶定量检测ABO血型抗原的方法，其特征在于，所述方法包含分型步骤；所述分型步骤为：将待分型红细胞分别添加至包被有抗A抗体的容器和包被有抗B抗体的容器中进行离心，离心结束后，洗涤，去除残液，再加入过氧化物酶底物，利用红细胞内源性过氧化物酶显色3
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20分钟，加入酸性溶液终止反应，然后置于酶标仪，在合适的光波下检测吸光度值，即OD值；若待分型红细胞在包被有抗A抗体的容器和包被有抗B抗体的容器检测OD值均小于Cutoff值，则待分型红细胞的ABO血型为O型；若待分型红细胞仅在包被有抗B抗体的容器检测OD大于Cutoff值，则待分型红细胞的ABO血型为B型；若待分型红细胞仅在包被有抗A抗体的容器检测OD值大于Cutoff值，则待分型红细胞的ABO血型为A型；若待分型红细胞在包被有抗A抗体的容器和包被有抗B抗体的容器检测OD值均大于Cutoff值，则待分型红细胞的ABO血型为AB型。2.如权利要求1所述的利用红细胞内源性过氧化物酶定量检测ABO血型抗原的方法，其特征在于，所述离心的转速为90
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360g、时间为1
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30min。3.如权利要求1所述的利用红细胞内源性过氧化物酶定量检测ABO血型抗原的方法，其特征在于，所述容器为微孔板，所述微孔板为U型微孔板或平底微孔板。4.如权利要求1所述的利用红细胞内源性过氧化物酶定量检测ABO血型抗原的方法，其特征在于，所述洗涤采用生理盐水进行3
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6次洗涤。5.如权利要求1所述的利用红细胞内源性过氧化物酶定量检测ABO血型抗原的方法，其特征在于，所述 Cutoff值=0.2。6.如权利要求1所述的利用红细胞内源性过氧化物酶定量检测ABO血型抗原的方法，其特征在于，所述分型步骤前，还包含稀释步骤；所述稀释步骤为：将待分型红细胞稀释至体积浓度为0.1
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1%。7.如权利要求6所述的利用红细胞内源性过氧化物酶定量检测ABO血型抗原的方法，其特征在于，所述待分型红细胞采用Liss或生理盐水进行稀...
【专利技术属性】
技术研发人员：高明，陈玉平，陈芳芳，徐丹，王布强，卞梦瑶，周蓉，卞国柱，
申请(专利权)人：江苏力博医药生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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