EpCAM单抗修饰的氧化石墨烯纳米粒肿瘤靶向基因递送载体系统技术方案

本发明专利技术公开了用于递送survivin

【技术实现步骤摘要】
EpCAM单抗修饰的氧化石墨烯纳米粒肿瘤靶向基因递送载体系统


[0001]本专利技术属于生物医药学领域，涉及一种具有靶向性的抗肿瘤基因药物递送系 统：GCE/siRNA。

技术介绍

[0002]近年来，基因治疗已迅速发展为一项重要的医疗技术并逐渐被广泛接受，在 多种疾病中，RNA干扰技术(RNA interference，RNAi)被认为是一种独特的基 因治疗方法。在基因治疗中，最常用的两种基因递送载体是病毒载体以及非病毒 载体。尽管逆转录病毒和腺病毒等病毒载体转染效率较高，但其生物安全问题限 制了其进一步的临床应用，如细胞毒性，高免疫原性和潜在的致癌性。目前，非 病毒载体如阳离子聚合物类(如聚乙烯亚胺PEI)、阳离子多糖、鱼精蛋白、阳 离子脂质和阳离子表面活性剂，因其低毒、低免疫原性和易制备等特点成为基因 治疗研究的热点。然而，非病毒载体的细胞转染效率不高和靶向性差的特点，使 其体内应用并不理想。因此，寻找一种高效、低毒、靶向性的非病毒载体已成为 基因治疗研究的最紧迫和最具挑战性的问题。
[0003]氧化石墨烯(graphene Oxide，GO)是石墨烯的一种衍生物，它是由单层sp2 杂化碳原子堆积形成的具有二维蜂窝状结构的碳材料。研究表明，GO表面有大 量的含氧官能团(羧基、羟基、环氧基)，以及大的共轭结构有利于共价和非共 价的功能化修饰。近年来，GO在生物医学领域引起了越来越多的关注，由于其 具有良好的水分散性、胶体稳定性、比表面积大、官能团丰富等优点而得到研究 和应用。许多研究都证明了GO可用于药物和基因载体的应用、细胞成像技术、 用于治疗和诊断疾病的生物传感器和抗菌材料。因此，在基因递送载体研究领域 中，有必要对GO进行适当的功能化修饰，来保证基因的负载能力和靶向性。壳 聚糖(chitosan，CS)是自然界中存在的无毒的唯一带正电荷的天然碱性多糖， 在体内可被生物降解，因此生物相容性较好，且分子结构中存在大量氨基基团， 可用于GO的正电化修饰。上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule， EpCAM)在正常组织中的表达只局限在上皮组织的基底膜处，而在肿瘤细胞中 则大量表达，尤其是腺癌和鳞状细胞癌中。利用anti
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EpCAM(epithelial celladhesion molecule antibody，EpCAM单克隆抗体)对GO进行修饰，可以起到主 动靶向的作用，实现药物或基因的靶向递送。
[0004]本专利技术对GO进行羧基化处理后，利用CS对其进行正电性修饰，然后利用 单克隆抗体anti
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EpCAM进行靶向性修饰，得到能够负载基因药物survivin
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siRNA 的靶向递送载体GCE。本专利技术为提高survivin
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siRNA的负载量，选用比表面积 较大的氧化石墨烯作为载体，并通过共价连接CS以及与靶向性单克隆抗体 anti
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EpCAM连接，制备得到GCE，用于负载survivin
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siRNA，并通过各项评价 确证了该递送系统的抗肿瘤效果和肿瘤靶向性。根据上述靶向基因药物递送载体 的制备与评价研究，专利技术人提出了本专利技术。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种具有靶向性的抗肿瘤基因药物递送系统： GO
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CS/anti
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EpCAM/survivin
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siRNA(GCE/siRNA)。
[0006]本专利技术所述的靶向基因药物递送系统，由靶向基因药物递送载体GCE和抗 肿瘤基因治疗药物survivin
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siRNA制备而成。
[0007]本专利技术所述的靶向基因药物递送系统，GCE与survivin
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siRNA的质量比为 20
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40:0.5
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2，优选为30:1。
[0008]本专利技术所述的靶向基因药物递送系统，为纳米结构。
[0009]本专利技术所述的靶向基因药物递送系统，靶向递送载体GCE由以下成分制成： GO、CS、anti
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EpCAM。
[0010]本专利技术的另一个目的在于提供基因递送载体的制备方法。
[0011]本专利技术所述的制备方法：基因递送载体GCE与抗肿瘤基因survivin
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siRNA 按照质量比为30:1在常温下混合，室温静置，即得GCE/siRNA。
[0012]其中，靶向递送载体GCE的制备：氧化石墨烯(GO)在NaOH溶液中，与 ClCH2COONa反应，得到羧基化的氧化石墨烯(GO
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COOH)，再通过与壳聚糖 (CS)进行酰胺化反应，得到GO
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CS，最后室温下与EpCAM单抗(anti
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EpCAM) 混合，得到GCE载体。
[0013]优选的，本专利技术所述的靶向基因药物递送系统的制备方法，包括以下步骤：
[0014]1)制备GO
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COOH
[0015]称取GO于圆底烧瓶中，加入水，超声使其形成均匀分散的GO分散液，冰 浴下，加入NaOH，再适当分散后，加入ClCH2COONa，超声反应，再使用磁 力搅拌器室温搅拌，反应停止后，将反应液离心后弃上清，沉淀用水洗涤至中性， 干燥，即得羧基化的氧化石墨烯GO
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COOH；
[0016]2)制备GO
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CS
[0017]称取GO
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COOH和CS溶于MES缓冲液中，超声使其均匀分散，称取EDC 和NHS，缓缓加入上述混合液中，继续超声；然后，将反应液室温下磁力搅拌， 反应停止后，将混合液离心后弃上清，用乙酸溶液多次洗涤沉淀物以除去未反应 的CS，再用水洗涤至中性，干燥，即得产物GO
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CS；
[0018]3)制备GCE
[0019]称取GO
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CS，超声使其均匀分散于水中，加入anti
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EpCAM，室温搅拌过夜， 反应停止后，将反应液离心，沉淀物用水洗涤，干燥，即得产物GCE；
[0020]4)制备GCE/siRNA
[0021]称取GCE分散在DEPC水中，超声使其分散均匀，再将GCE与 survivin
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siRNA混合，室温静置，即得GCE/siRNA。
[0022]进一步优选的，本专利技术所述的靶向基因药物递送系统的制备方法，包括以下 步骤：
[0023]1)制备GO
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COOH
[0024]称取50mg GO于圆底烧瓶中，加入30mL水，超声使其形成均匀分散的 GO分散液，冰浴下，加入5g NaOH，再适当分散后，加入5g ClCH2COONa， 超声反应3h，再使用磁力搅拌器室温搅拌2h。反应停止后，将反应液离心(10 000
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种具有靶向性的抗肿瘤基因药物递送系统GCE/siRNA。2.权利要求1所述的具有靶向性的抗肿瘤基因药物递送系统，其特征在于，由靶向基因递送载体GCE和抗肿瘤基因治疗药物survivin
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siRNA制备而成。3.权利要求1所述的具有靶向性的抗肿瘤基因药物递送系统，其特征在于，GCE与survivin
‑
siRNA的质量比为20
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40:0.5
‑
2，优选为30:1。4.权利要求1所述的具有靶向性的抗肿瘤基因药物递送系统，其特征在于，靶向基因递送载体GCE由以下成分制成：GO、CS、anti
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EpCAM。5.权利要求1所述的具有靶向性的抗肿瘤基因药物递送系统，其特征在于，靶向基因递送载体GCE的制备方法为：氧化石墨烯在NaOH溶液中，与ClCH2COONa反应，得到羧基化的氧化石墨烯，再通过与壳聚糖进行酰胺化反应，得到GO
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CS，最后室温下与EpCAM单抗混合，得到GCE载体。6.权利要求1所述的具有靶向性的抗肿瘤基因药物递送系统，其特征在于，该基因递送系统为纳米结构。7.权利要求1所述的具有靶向性的抗肿瘤基因药物递送系统的制备方法，包括以下步骤：取基因递送载体GCE与抗肿瘤基因survivin
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siRNA按照质量比为30:1在常温下混合，室温静置，即得GCE/siRNA。8.权利要求1所述的具有靶向性的抗肿瘤基因药物递送系...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔纯莹，张爽，孙琪，陈思，
申请(专利权)人：首都医科大学，
类型：发明
国别省市：