干细胞外泌体在制备皮肤光老化修复产品中的应用制造技术

本发明专利技术涉及干细胞外泌体在制备皮肤光老化修复产品中的应用。本发明专利技术通过杂交瘤筛选制备并获得了特异性针对EGFR的单克隆抗体，所述单克隆抗体能够有效的干预紫外照射后细胞内c

【技术实现步骤摘要】
干细胞外泌体在制备皮肤光老化修复产品中的应用


[0001]本申请涉及生物领域，更具体的涉及干细胞外泌体制备皮肤光老化药物中的用途。

技术介绍

[0002]皮肤光老化(skin photoaging)是由于皮肤长期受到日光照射所引起的损害，是自然老化和紫外线辐射共同作用的结果。表现为皮肤曝光部位粗糙、增厚、干燥，皮肤松弛、皱纹加深加粗，局部有过度的色素沉着或毛细血管扩张，甚至可能出现各种良性或恶性肿瘤(如日光角化病、鳞状细胞癌、恶性黑素瘤等)。光老化多见于老年人，男性比女性多见，好发于面部、颈部、前胸、后背与两上肢前臂。皮肤干燥、粗糙，有明显的皱纹，皮肤色素较重生黑色，这是由于长期紫外线照晒发生的不规则色素沉着加上光化性紫癜致使发生含铁血黄素的沉积。同时也可以发生日光性雀斑样痣。皮肤皱纹明显，皱纹面积很大，沟纹较深，形成铺路石样。面部出现毛细血管扩张也是皮肤光老化的一种常见临床表现，长期野外工作、风吹日晒刺激是其形成的主要原因之一。此外，皮肤长期受到强烈的日光照射，甚至有可能会出现各种良性或恶性肿瘤，如日光性角化病、鳞状细胞癌、恶性黑色素瘤等。
[0003]干细胞是一类具有多向分化潜能并能够进行持续自我更新的未分化细胞，可分化为体内多种类型的成体细胞。在干细胞的研究中，干细胞培养基的上清液中可提取多种生长因子和细胞因子，因此，普遍的观点认为干细胞主要通过旁分泌途径分泌多种细胞因子参与组织修复。研究发现，对含有骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSC)的条件培养液进行分馏研究中，只有含有100～200nm囊泡培养液可对缺血再灌注损伤的小鼠模型进行心脏保护。目前研究者认为，通过分泌某些物质来实现修复作用是干细胞发挥生物学功能的重要方式。有研究表明外泌体在
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80℃保存2年仍能保持其生物学功能。在体内实验中外泌体的脂质双分子膜结构能防止其内容物降解，保持内部蛋白及遗传物质的活性。而且与干细胞分泌的可溶性细胞因子不同，外泌体可直接进入靶细胞，通过向靶细胞转运特异性蛋白、脂质及RNA等生物活性物质，来诱导靶细胞的增殖、迁移、血管化等生物学变化，从而改变局部微环境，稳定而持久地发挥多种生物学功能。这种“载体式”信号转导方式使外泌体具备更高更稳定的信号转导效率，且在生物体内不会被细胞外介质稀释。研究发现，MSC外泌体可通过促进血管生成发挥组织修复作用。研究发现，MSC外泌体可促进热刺激后皮肤细胞的增殖，并抑制其凋亡，在大鼠皮肤烧伤模型中，外泌体能促进烧伤部位的再上皮化，加快伤口愈合。人脐带MSC外泌体所递送的Wnt4基因信号是皮肤伤口愈合所需的。在体外实验中,成纤维细胞和人脐静脉内皮细胞的增殖及迁移依赖于MSC外泌体的剂量。同样，成纤维细胞分泌的I型、III型胶原、弹性蛋白量的提高和血管内皮细胞管状形成率的提高也与外泌体的浓度增加有关。皮肤光老化是人体衰老的最直接表现，主要是由于紫外线照射后导致基质金属蛋白酶MMP异常上调，致真皮基质合成与降解之间不平衡。用源自ADSCs的EV治疗后会显著抑制紫外线照射诱导的MMP
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1、2、3、9的过表达，并增强I、Ⅱ、Ⅲ、V型胶原蛋白和弹性蛋白的表达。研究证明，富含ADSCs
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EV的多种成分可以促进皮肤光老化恢复。研
究发现，通过超声波制备的HUCMSCs衍生的外泌体，结果发现其可能用于增加皮肤细胞外基质并增强皮肤恢复活力。通过分离来自在三维培养系统中生长的外泌体，并探索它们调节HaCaT角质形成细胞光老化的能力，从而发现HUCMSCs衍生的外泌体能够增强正常的HaCaT细胞增殖和迁移，同时抑制UVB诱导的对这些细胞的损伤。这些外泌体还减少了光老化HaCaT细胞中的HaCaT细胞凋亡和衰老，增加了胶原I型表达并降低了基质金属蛋白酶(MMP1)的表达。胶原蛋白的增加是皮肤保持活力及年轻化的关键东西。这一研究证实人脐带间充质干细胞来源的外泌体在治疗皮肤衰老方面有很大的空间，为临床抗衰提供了一种新型的策略。为了进一步探究HUCMSCs
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ex是否能防止紫外线辐射引起的急性皮肤光损伤，有研究者通过建立急性光损伤(连续三天的紫外线辐射诱导皮肤组织发红，脱屑和炎症细胞浸润)的大鼠模型，发现体内皮下注射的HUCMSCs
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ex可保护皮肤细胞免受紫外线辐射诱导的DNA损伤、炎症和细胞凋亡，较为明显的减少了皮肤炎症并促进了皮肤细胞再生。其主要是由HUCMSCs
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ex递送的14
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3ζ蛋白通过调节SIRT1依赖性抗氧化途径发挥细胞保护功能。
[0004]在研究中也发现，皮肤受到外界刺激条件时会导致细胞表面受体的激活，进而激活细胞内信号转导级联反应，调节细胞的表型变化。根据RNA
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Seq的数据分析结果，检测了细胞表面受体表皮生长因子受体(EGFR)的蛋白磷酸化变化，结果发现蓝光可通过激活EGFR蛋白磷酸化，进而诱导MMP1的表达。在此基础上，丁香提取物以及鞣花酸等可抑制EGFR通路激活的抗皮肤老化衰老成分，如PAL
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12等。因此，含有EGFR抑制剂的化妆品制备的防晒霜或者防嗮药物，在一定程度上可降低蓝光对皮肤的损伤作用。但是目前，针对皮肤光损伤的修复药物种类还不够多，还有进一步提高的空间。

技术实现思路

[0005]基于EGFR抑制剂可以有效的治疗皮肤老化衰老，本专利技术开发了特异性的广谱的EGFR抑制剂
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EGFR单克隆抗体。
[0006]由于皮肤光老化的信号转导机制是UVB和UVA激活细胞表皮细胞生长因子受体(EGFR)和细胞因子受体。因此，EGFR单克隆抗体能够抑制EGFR表达从而治疗皮肤光老化。
[0007]一方面，本专利技术提供一种特异性针对EGFR的单克隆抗体4F6，所述单克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0008]在本专利技术的一些实施例中，所述单克隆抗体包括下列至少之一：(a)具有SEQ ID NO:2所示重链可变区和SEQ ID NO:1所示轻链可变区；(b)与(a)相比，具有至少一个保守氨基酸取代。本专利技术所提供的单克隆抗体的重链可变区可以为SEQ ID NO:2所示序列，轻链可变区可以为SEQ ID NO:1所示序列；也可以在SEQ ID NO:2所示序列或者SEQ ID NO:1所示序列的基础上，进行至少一个保守氨基酸取代，例如可以是1个保守氨基酸取代，2个保守氨基酸序列，3个保守氨基酸取代，4个保守氨基酸取代等等。这些保守氨基酸取代优选发生在重链可变区和轻链可变区的非高变区域。由此所提供的单克隆抗体具有对高保真DNA聚合酶具有高的亲和力，应用于PCR反应中，特异性强，准确性高。
[0009]本文中，“保守氨基酸取代”指的是在生物学上、化学上或者结构上，氨基酸被另一相似氨基酸所取代。生物学上相似的氨基酸指的是通过氨基酸的取代不会破坏所提供的单克隆抗体的生物学活性。结构上相似的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种特异性针对EGFR的单克隆抗体4F6，所述单克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。2.如权利要求1所述的单克隆抗体4F6在制备修复皮肤成纤维细胞光损伤的药物中的用途。3.如权利要求1所述的单克隆...

【专利技术属性】
技术研发人员：李龙，房斌，耿军生，
申请(专利权)人：北京华正博研科技有限公司，
类型：发明
国别省市：