一种恒温多重扩增检测肝豆状核变性ATP7B基因高频突变位点基因分型的检测方法技术

本发明专利技术提供了一种恒温多重扩增检测肝豆状核变性ATP7B基因高频突变位点基因分型的引物组合、试剂盒、检测体系、检测方法和应用。本发明专利技术方法是基于扩增阻遏突变系统技术结合切口内切酶核酸恒温扩增检测反应体系，对肝豆状核变性ATP7B基因的3个高频致病变异位点进行单管多重扩增，同时结合毛细管电泳进行产物分析，以达到进行基因分型检测的目的。以达到进行基因分型检测的目的。

【技术实现步骤摘要】
一种恒温多重扩增检测肝豆状核变性ATP7B基因高频突变位点基因分型的检测方法


[0001]本专利技术属于分子生物学领域，尤其是涉及一种基于恒温，多重扩增的基因SNP分型的检测方法及检测体系。

技术介绍

[0002]肝豆状核变性又称Wilson病，是一种以铜代谢障碍为特征的常染色体单基因隐性遗传疾病，病变主要累及肝脏、脑、肾脏和角膜等部位，引起进行性加重的肝硬化、基底节损害、肾脏损害及角膜色素环等。目前，肝豆状核变性的全球患病率大约为1/3万，在隔离人群(如撒丁岛)中，患病率可达1/1万，中国香港汉族患病率高达1/5400。
[0003]目前，肝豆状核变性的诊断主要依靠典型的临床表现、实验室检查及基因检测，治疗包括青霉胺、锌制剂和肝移植等。早期诊断和早期干预对于延缓疾病的进展和预防不可逆的后遗症至关重要。
[0004]当ATP7B基因发生突变时，ATP7B在细胞内的表达量和/或定位发生改变，其转运铜能力下降，引起血清铜蓝蛋白合成减少、胆管排铜受阻。过量的铜蓄积在体内，引起细胞坏死和器官损害，后期严重影响患者的生活质量，最终可引起死亡。
[0005]目前检测SNP的方法有很多，sanger测序法，焦磷酸测序，taqman探针，arms
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PCR，HRM高分辨融解曲线等等，但几乎所有方法都需要用到PCR扩增技术，操作复杂，检测周期长，且需要有一个变温的过程，这样就导致需要一个能变温的仪器模块，比如PCR仪，价格较贵，使得该技术推广受限。

技术实现思路

[0006]针对现有技术中的这些缺点，本专利技术提供了一种通过恒温多重检测ATP7B基因高频突变位点SNP分型检测方法及检测引物和体系。本专利技术采用ARMS技术结合NEAR恒温扩增体系对ATP7B基因3个高频致病变异位点进行单管多重扩增，同时结合毛细管电泳进行产物分析，进行基因分型检测。
[0007]本专利技术具有如下有益效果
[0008]1)本专利技术提供了一种快速用于SNP基因分型检测的ARMS
‑
联合切口内切酶介导的恒温扩增的新方法，可实现快速，高效，且成本低对3
‑
40个SNP位点进行同时分型；
[0009]2)本专利技术采用恒温的反应体系，可以最大程度降低对高精密仪器的依赖。众所周知，PCR仪由于升降温模块，精密度要求较高，不同的PCR仪容易由于升降温速率不同，导致结果不稳定，或者不同实验室结果不一致，同时PCR仪成本也较高。本专利技术的恒温体系有助于降低分子生物学检测的门槛，将变温模块去掉，降低仪器成本；
[0010]3)扩增反应快速高效：切口内切酶技术反应条件温和，反应高效快速，可以在15
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30分钟内得到扩增的片段，相比传统PCR技术需要1.5
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2小时，大大缩短了反应时间，做到了快速高效，这对快速诊断起到了积极的作用；
[0011]4)本专利技术采用多重扩增体系结合毛细管对产物进行片段分析，使检测结果直观，易判读。本专利技术采用多重复合扩增体系联合毛细管电泳分析，实现通过单管的多重扩增，一次性检测多个SNP位点的分型，且检测结果易分析和判读，这相比市面上其他单重检测方法，在提高了检测效率和简化操作步骤的基础上，又进一步降低了检测试剂成本。
[0012]5)本专利技术的方法实现通量高、特异性强，灵敏度高，且操作简单，快速高效且成本低。
[0013]根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种肝豆状核变性ATP7B基因高频突变位点基因的引物组合，所述引物组合在同一PCR体系中可以同时扩增如下3个风险位点：
[0014]p.R778L位点；
[0015]p.P992L位点；和
[0016]p.T935M位点。
[0017]根据本专利技术的某些实施方式，每一条引物都包含一个切口内切酶的限制位点的识别位点，一个稳定区域，一个与靶标互补的靶标结合区核酸链；以及各检测位点SNP识别特异性上游引物在3
’
端包括在
‑
2或者
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3位引入一个碱基的错配，和最后一个碱基对应SNP位点的具体碱基。
[0018]根据本专利技术的某些实施方式，所述引物对针对每个位点包括野生型上游引物，突变型上游引物，和共用下游引物。
[0019]根据本专利技术的某些实施方式，所述引物组合序列包括SEQ ID NO.1
‑
9。
[0020]根据本专利技术的某些实施方式，标记有用于后期毛细管电泳检测所识别的荧光基团，所述荧光基团修饰在特异性引物段的一个T碱基上，所述荧光基团可用FAM、HEX、ROX、TAMER或者CY5修饰。
[0021]根据本专利技术的某些实施方式，所述荧光基团标记在各检测位点共用下游引物的特异性引物段上距离切口内切酶识别位点3
’
末端的3
‑
8个碱基的一个T碱基上。
[0022]根据本专利技术的某些实施方式，所述荧光基团标记在所述各检测位点共用下游引物的特异性引物段上距离切口内切酶识别位点3
’
末端的第3
‑
8个碱基的一个T碱基上，例如3
‑
6个碱基、3
‑
5个碱基、5
‑
8个碱基、5
‑
6个碱基或6
‑
8个碱基。
[0023]根据本专利技术的某些实施方式，所述荧光基团标记在所述各检测位点共用下游引物的特异性引物段上距离切口内切酶识别位点3
’
末端的第3个碱基、4个碱基、5个碱基、6个碱基、7个碱基或8个碱基的一个T碱基上。
[0024]根据本专利技术的某些实施方式，所述引物组合中，所述上游引物的量是所述下游引物的4倍。
[0025]根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种肝豆状核变性ATP7B基因高频突变位点基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括所述引物组合，NERA恒温复合扩增酶混合物，10X反应缓冲液，dNTP阳性对照品及毛细管电泳所需内标。
[0026]根据本专利技术的某些实施方式，所述NERA恒温复合扩增酶混合物包括切口内切酶和DNA聚合酶。
[0027]根据本专利技术的某些实施方式，所述切口内切酶可以选自N.ALwl,Nb.BbvCI,Nt.BbvCI,Nt.BstNBI,Nb.BsmI或者其他相似的切口内切酶。
[0028]根据本专利技术的某些实施方式，所述切口酶优选Nt.Bst NBI切口酶。
[0029]根据本专利技术的某些实施方式，所述DNA聚合酶选自Bst DNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、phi29 DNA聚合酶或者其他类似的具有链置换活性的DNA聚合酶。
[0030]根据本专利技术的某些实施方式，所述DNA聚合酶优选Nt.BstNBI
‑
Bst 3.0聚合酶。
[0031]根据本专利技术的某些实施方式，所述10X反应缓冲液为：20mM MgSO4,1500mM KCl本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肝豆状核变性ATP7B基因高频突变位点基因的引物组合，其特征在于，所述引物组合在同一PCR体系中可以同时扩增如下3个风险位点：p.R778L位点；p.P992L位点；和p.T935M位点；其中每一条引物都包含一个切口内切酶的限制位点的识别位点，一个稳定区域，一个与靶标互补的靶标结合区核酸链(特异性引物段)；以及各检测位点SNP识别特异性上游引物在3
’
端包括在
‑
2或者
‑
3位引入一个碱基的错配，和最后一个碱基对应SNP位点的碱基。2.根据权利要求1所述的引物组合，其特征在于，其中，所述引物对针对每个位点包括野生型上游引物，突变型上游引物，和共用下游引物；所述引物组合序列包括SEQ ID NO.1
‑
9。3.根据权利要求2所述的引物组合，其特征在于，标记有用于后期毛细管电泳检测所识别的荧光基团，所述荧光基团修饰在特异性引物段的一个T碱基上，所述荧光基团可用FAM、HEX、ROX、TAMER或者CY5修饰；优选所述荧光基团标记在所述各检测位点共用下游引物的特异性引物段上距离切口内切酶识别位点3
’
末端的3
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8个碱基的一个T碱基上。4.根据权利要求2所述的引物组合，其特征在于，所述引物组合中，所述上游引物的量是所述下游引物的4倍。5.一种肝豆状核变性ATP7B基因高频突变位点基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括根据权利要求1
‑
4中任一项所述的引物组合，NERA恒温复合扩增酶混合物，10X反应缓冲液，dNTP(10mM)，阳性对照品及毛细管电泳所需内标。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，NERA恒温复合扩增酶混合物包括切口内切酶和DNA聚合酶，其中切口内切酶可以选自N.ALwl,Nb.BbvCI,Nt.BbvCI,Nt.BstNBI,Nb.BsmI或者其他相似的切口内切酶；所述DNA聚合酶选自Bst DNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、phi29 DNA聚合酶或者其他类似的具有链置换活性的DNA聚合酶。7.根据权利要求6所...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴志英，董毅，金芬芬，
申请(专利权)人：绍兴博英诊断技术有限公司，
类型：发明
国别省市：