一种高活性鲍氏不动杆菌黄嘌呤氧化酶突变体及其应用制造技术

一种高活性鲍氏不动杆菌黄嘌呤氧化酶突变体及其应用，该突变体是将鲍氏不动杆菌黄嘌呤氧化酶Y351V的β亚基进行Q201N突变后获得的。本发明专利技术的鲍氏不动杆菌黄嘌呤氧化酶突变体利用空气中氧气作为电子受体，催化氧化黄嘌呤底物的比活力增强1.53倍，催化效率增强4.58倍，其在高浓度次黄嘌呤和/或黄嘌呤体系中具有更高的催化活性。且催化氧化作用最适温度比野生型黄嘌呤氧化酶Y351V低10℃，能够在pH＝9的碱性条件下进行，可降低生产成本，更加适用于工业化生产应用。于工业化生产应用。

【技术实现步骤摘要】
一种高活性鲍氏不动杆菌黄嘌呤氧化酶突变体及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体是一种高活性鲍氏不动杆菌黄嘌呤氧化酶突变体及其应用，是在鲍氏不动杆菌黄嘌呤氧化酶的基础上，通过点突变制造活性增强的黄嘌呤氧化酶突变体，及其在降解含次黄嘌呤和黄嘌呤材料中的应用。

技术介绍

[0002]黄嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase，简称XOD)是一种含钼氧化还原酶，能够催化包括嘌呤、喋呤以及醛酸在内的sp2杂化碳原子，因此具有重要的商业应用价值，其中XOD的应用主要涉及五个方面，分别是药物代谢、核苷类药物合成、体外检测、生物修复、健康食品方面(王成华、邢新会.黄嘌呤氧化酶的研究进展及其发展前景[J].广西科学,2017,24(1):15
‑
24.)。
[0003]XOD是由前体蛋白黄嘌呤脱氢酶(Xanthine Dehydrogenase，XDH)经过巯基氧化可逆转变或者通过酶解断裂不可逆转变而来，利用分子O2作为电子受体，但失去了XDH所具有的利用NAD+作为电子受体的能力。它们是同一基因转录表达的产物，其中XDH是基因转录后的直接产物，是在体内的主要存在状态(Woolfolk,C.A.and Downard,J.S.Distribution of xanthine oxidase and xanthine dehydrogenase specificity types among bacteria.J Bacteriol,1977.130(3):1175
‑
91)。相对于XDH利用昂贵的NAD+作为电子受体而言，可以直接利用空气中O2作为电子受体的XOD成为商业用酶的首选。
[0004]本专利技术人前期研究获取了一种新的荚膜红细菌来源XDH(申请号201410764840.5，专利技术人邢新会、王成华、张翀，一种黄嘌呤脱氢酶及其编码基因与应用)，一种新的鲍氏不动杆菌来源XDH(申请号201510406718.5，专利技术人邢新会、王成华、张翀、苏楠，一种碱性黄嘌呤脱氢酶及其在检测试剂盒中的应用)。并通过基因工程手段获取了更高催化活性的截断体形式变体XDH(申请号201510048275.7，专利技术人邢新会、王成华、张翀，一种黄嘌呤脱氢酶截断体及其应用)，一种黄嘌呤脱氢酶突变体(申请号201710152663.9，专利技术人邢新会、王成华、张翀，黄嘌呤脱氢酶突变体及其应用)，以及一种具有氧化酶功能的黄嘌呤脱氢酶突变体(申请号201911098145.9，专利技术人王成华、朱春燕、谢锋、张婷、张冉，一种鲍氏不动杆菌黄嘌呤脱氢酶突变体及其应用)。随着研究及应用领域的扩展，有必要进一步开发催化效率更好的新型XOD。如果能将鲍氏不动杆菌来源XOD蛋白改造成具有高活性的XOD，将对扩大其应用范围具有重要意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种高活性鲍氏不动杆菌黄嘌呤氧化酶突变体及其应用。
[0006]本专利技术所提供的鲍氏不动杆菌黄嘌呤氧化酶突变体具备增强的黄嘌呤氧化酶的活性，该突变体酶是由α亚基和β亚基构成，所述α亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述β亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0007]与亲本型鲍氏不动杆菌黄嘌呤氧化酶相比，本专利技术所提供鲍氏不动杆菌黄嘌呤氧
化酶的α亚基(SEQ ID NO.1)的第351位的酪氨酸(Y)替换为缬氨酸(V)，β亚基(SEQ ID NO.2)的第201位的谷氨酰胺(Q)替换为天冬酰胺(N)。该突变记为Q201N。
[0008]编码所述鲍氏不动杆菌黄嘌呤氧化酶突变体的核酸分子也属于本专利技术的保护范围。
[0009]所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；
[0010]所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。
[0011]在本专利技术的实施例中，所述核酸分子具体为编码所述鲍氏不动杆菌黄嘌呤氧化酶突变体的基因，所述基因具体为如下1)
‑
4)中任一所示DNA分子：
[0012]1)将SEQ ID NO.3的第2102
‑
2104位的cag替换为aac后所得序列所示DNA分子；
[0013]2)将SEQ ID NO.3的第2102
‑
2104位的cag替换为aac后所得序列的第1502
‑
2377位所示DNA分子；
[0014]3)在严格条件下与1)
‑
2)中任一所限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白的DNA分子；
[0015]4)与1)
‑
3)中任一所限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。
[0016]上述严格条件可为用6
×
SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2
×
SSC，0.1％SDS和1
×
SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
[0017]上述1)和2)所示基因为编码鲍氏不动杆菌黄嘌呤氧化酶突变体Q201N的基因。
[0018]用于制造黄嘌呤氧化酶突变体的亲本基因为一种来源于鲍氏不动杆菌的新型黄嘌呤氧化酶突变体Y351V的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3表示，SEQ ID NO.3自5
’
末端起第1位至第1500位核苷酸所示的DNA分子编码α亚基，第1502位至第3877位核苷酸所示的DNA分子编码β亚基。所述基因中，除了α亚基及β亚基外，还包括对形成活性黄嘌呤氧化酶必须的伴侣蛋白进行编码的碱基序列，其对应的碱基序列为第3884位至4867位。由于本专利技术的黄嘌呤氧化酶突变体Q201N只在亲本型酶β亚基中发生突变，因此具有与野生酶相同的氨基酸序列的α亚基及伴侣蛋白。
[0019]含有上述DNA分子的重组载体、表达盒、宿主细胞或重组菌也是本专利技术保护的范围。
[0020]所述转基因细胞系不包括动物和植物的繁殖材料。
[0021]在本专利技术的一个实例中，所述重组载体具体为“将SEQ ID NO.3的第2102
‑
2104位的cag替换为aac后所得序列所示DNA分子”替换pTrc99A质粒NcoI和HindIII酶识别位点间DNA片段得到的重组质粒，命名为pTRAN
‑
Y351V
‑
Q201N。该重组载体即为产鲍氏不动杆菌黄嘌呤氧化酶突变体的重组质粒，表达鲍氏不动杆菌黄嘌呤氧化酶突变体。
[0022]在本专利技术中，所述微生物具体为将所述重组载体转化大肠杆菌后得到的重组大肠杆菌。
[0023]其中，所述转化可以是把所述重组载体引入到宿主细胞时所使用的一切方法。比如，把所述表达载体引入到宿主细胞的方法包括但不限于氯化钙及热冲击转化法、离子枪冲击法、电穿孔法、超声波处理、通过PEG的沉淀法。
[0024]所述鲍氏不动杆菌黄嘌呤氧化酶突变体作为黄嘌呤氧化酶在如下任一中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高活性鲍氏不动杆菌黄嘌呤氧化酶突变体，其特征在于：该突变体酶是由
ɑ
亚基和β亚基构成，所述
ɑ
亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述β亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的第201位谷氨酰胺(Q)替换为天冬酰胺(N)后得到的氨基酸序列所示的亚基。2.编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。3.根据权利要求2所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子为编码权利要求1所述蛋白质的基因，所述基因为如下1)
‑
4)中任一所示的DNA分子：1)将SEQ ID NO.3的第2102
‑
2104位的cag替换为aac后所得序列所示DNA分子；2)将SEQ ID NO.3的第2102
‑
2104位的cag替换为aac后所得序列的第1501
‑
2377位所示的DNA分子；3)在严格条件下与1)
‑
2)中任一限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白的DNA分子；4)与1)
‑
3)中任一所限定的DNA序列具有90％以上的同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。4.一种制备权利要求1所述蛋白质的方法，是将权利要求2或3中任一所述的核酸分子导入大肠杆菌进行诱导表达，得到所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：王成华，徐佳慧，文佑，潘冬雷，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：