一种下呼吸道样本处理试剂、诺卡菌检测试剂盒及核酸扩增方法技术

本发明专利技术公开了一种下呼吸道样本处理试剂、诺卡菌检测试剂盒及核酸扩增方法，涉及医疗领域。现提出如下方案，其包括下呼吸道样本处理试剂、核酸扩增方法及诺卡菌检测试剂盒。下呼吸道处理试剂，下呼吸道处理试剂的处理试剂配方为质量分数2％氢氧化钠、蒸馏水和体积分数60％异丙醇，PCR反应液配方为Nocardia

【技术实现步骤摘要】
一种下呼吸道样本处理试剂、诺卡菌检测试剂盒及核酸扩增方法


[0001]本专利技术涉及医疗领域，尤其涉及一种下呼吸道样本处理试剂、诺卡菌检测试剂盒及核酸扩增方法。

技术介绍

[0002]诺卡菌主要引起人类肺部感染。然而，肺诺卡菌病和肺结核病临床症状和影像学表现难以区分。前者目前主要依赖于临床微生物实验室培养技术，但该方法灵敏度低，这在很大程度上制约了诺卡菌病的精确诊治。基于此，本项目拟开展研发一款以16S rRNA基因为靶点、高灵敏度和特异性的多重实时荧光PCR产品用于检测诺卡菌。本项目利用患者的痰和肺泡灌洗液展开回顾性研究，以16S rRNA基因扩增子测序为金标准，对前期设计的TaqMan
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MGB探针和引物进行效能评估，以期为临床诊断肺诺卡菌病提供依据，为诺卡菌病的早期精准治疗提供帮助。
[0003]诺卡菌在环境中广泛存在，可感染免疫功能正常人群，其引起感染性疾病的诊断目前主要依赖于传统培养和染色技术，然而较低的灵敏度在很大程度上制约了诺卡菌病的准确诊断。有相当数量的诺卡菌病例被误诊为结核病，抗结核治疗不仅无法起到治疗效果，还会导致患者菌群失衡。伴随着诺卡菌病的发病率逐步升高，其与结核病的鉴别诊断越发重要，是临床的迫切需求。
[0004]所以，发展多重实时荧光PCR法检测诺卡菌不仅可满足临床鉴别诊断的需求，还可促进诺卡菌病的精准用药治疗，节约国家医疗资源。

技术实现思路

[0005](一)专利技术目的
[0006]有鉴于此，本专利技术的目的在于提出一种下呼吸道样本处理试剂、诺卡菌检测试剂盒及核酸扩增方法，以实现对肺诺卡菌病进行诊断，可提高诺卡菌病确诊率，从而避免误诊误治，并且有效降低社会医疗费用支出。
[0007](二)技术方案
[0008]为达到上述技术目的，本专利技术提供了一种下呼吸道样本处理试剂，包括下呼吸道处理试剂，下呼吸道处理试剂的处理试剂配方为质量分数2％氢氧化钠、蒸馏水和体积分数60％异丙醇。
[0009]优选的，处理试剂配方每100mL的配比比例为：2g氢氧化钠、40mL蒸馏水和60mL异丙醇。
[0010]优选的，处理试剂配方每1000mL的配比比例为：20g氢氧化钠、400mL蒸馏水和600mL异丙醇。
[0011]优选的，处理试剂加入呼吸道标本，呼吸道标本分为痰和支气管肺泡灌洗液，加入比例计算方式为每x体积(mL)的痰放入2x体积(mL)的处理试剂，每x体积(mL)的支气管肺泡
灌洗液放入2x体积(mL)的处理试剂。
[0012]优选的，如上权利要求1
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4任一所述的下呼吸道样本处理试剂，还包括以下步骤：
[0013]步骤一：将下呼吸道标本加入处理试剂，用振荡器震荡15s，室温静置15min，充分进行消化；
[0014]步骤二：取200μL步骤1中液体加入至核酸提取的提取试剂盒中；
[0015]步骤三：将提取试剂盒放入GP全自动快速核酸提取仪Nextrator48，选择程序Protocol1进行核酸提取；
[0016]步骤四：待提取结束后，将核酸产物用移液器吸出至1.5mL EP管中，并放4℃环境下存储箱中备用。
[0017]步骤五：按比例配制PCR反应液，并进行分装至PCR八连管，每管23μL。
[0018]步骤六：将2μL核酸产物加入至步骤五的PCR反应液中，在ABI
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7500核酸扩增仪上设置如下程序进行核酸扩增反应。
[0019]步骤七：待PCR反应完成后，进行结果判读。
[0020]优选的，步骤五中PCR反应液配方为Nocardia
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F primer、Nocardia
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R primer、Nocardia
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Taqman probe、Globin
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F primer、Globin
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R primer、Globin
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Taqman probe、ddH2O和PCR master mix。
[0021]优选的，步骤五中PCR反应液配比为0.8μL的Nocardia
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F primer、0.8μL的Nocardia
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R primer、0.4μL的Nocardia
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Taqman probe、0.3μL的Globin
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F primer、0.3μL的Globin
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R primer、0.3μL的Globin
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Taqman probe、7.6μL的ddH2O和12.5μL的PCR master mix，总体积23μL，步骤五中PCR反应液中Nocardia
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F primer、Nocardia
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R primer、Nocardia
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Taqman probe、Globin
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F primer、Globin
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R primer和Globin
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Taqman probe的最终浓度为0.32μM、0.32μM、0.16μM、0.12μM、0.12μM和0.12μM。
[0022]优选的，步骤七中结果判读方法为：Nocardia
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Taqman probe为阴性，Globin
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Taqman probe为阳性，则诺卡菌检测阴性；
[0023]Nocardia
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Taqman probe为阳性，Globin
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Taqman probe为阳性或阴性，则诺卡菌检测阳性；
[0024]Nocardia
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Taqman probe与Globin
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Taqman probe皆为阴性，结果无法确定，PCR反应抑制，需对提取核酸产物进行5倍稀释后重新进行试验。
[0025]优选的，步骤六中程序设置方法为：
[0026]步骤一、循环一次，温度设定95℃，工作时间3min；
[0027]步骤二、温度设定95℃，工作时间15s，温度设定60℃，工作时间1min，循环40次；
[0028]优选的，所述诺卡菌检测试剂盒应用于放置PCR扩增试剂与处理试剂。
[0029]从以上技术方案可以看出，本申请具有以下有益效果：
[0030]通过在该产品对肺诺卡菌病进行诊断，可提高诺卡菌病确诊率，从而避免误诊误治，并且有效降低社会医疗费用支出。
附图说明
[0031]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本
专利技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
[0032]图1为本本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种下呼吸道样本处理试剂，包括下呼吸道处理试剂，其特征在于，下呼吸道处理试剂的处理试剂配方为质量分数2％氢氧化钠、蒸馏水和体积分数60％异丙醇。2.根据权利要求1所述的一种下呼吸道样本处理试剂，其特征在于，处理试剂配方每100mL的配比比例为：2g氢氧化钠、40mL蒸馏水和60mL异丙醇。3.根据权利要求2所述的一种下呼吸道样本处理试剂，其特征在于，处理试剂配方每1000mL的配比比例为：20g氢氧化钠、400mL蒸馏水和600mL异丙醇。4.根据权利要求4所述的一种下呼吸道样本处理试剂，其特征在于，处理试剂加入呼吸道标本，呼吸道标本分为痰和支气管肺泡灌洗液，加入比例计算方式为每x体积(mL)的痰放入2x体积(mL)的处理试剂，每x体积(mL)的支气管肺泡灌洗液放入2x体积(mL)的处理试剂。5.一种核酸扩增方法，其特征在于，如上权利要求1
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4任一所述的下呼吸道样本处理试剂，还包括以下步骤：步骤一：将下呼吸道标本加入处理试剂，用振荡器震荡15s，室温静置15min，充分进行消化；步骤二：取200μL步骤1中液体加入至核酸提取的提取试剂盒中；步骤三：将提取试剂盒放入GP全自动快速核酸提取仪Nextrator48，选择程序Protocol1进行核酸提取；步骤四：待提取结束后，将核酸产物用移液器吸出至1.5mL EP管中，并放4℃环境下存储箱中备用。步骤五：按比例配制PCR反应液，并进行分装至PCR八连管，每管23μL。步骤六：将2μL核酸产物加入至步骤五的PCR反应液中，在ABI
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7500核酸扩增仪上设置如下程序进行核酸扩增反应。步骤七：待PCR反应完成后，进行结果判读。6.根据权利要求5所述的一种核酸扩增方法，其特征在于，步骤五中PCR反应液配方为Nocardia
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F primer、Nocardia
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R primer、Nocardia
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Taqman probe、Globin
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F primer、Globin
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R primer、Globin
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Taqman probe、ddH2O和PCR master mix。7.根据权利要求6所述的一种核酸扩增方法，其特征在于，步骤五中PCR反应液配...

【专利技术属性】
技术研发人员：隗明，王帅，王鹏，刘骏，谷丽，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京朝阳医院，
类型：发明
国别省市：