一种体外扩增冷冻保存的淋巴结抗肿瘤T细胞的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种体外扩增冷冻保存的淋巴结抗肿瘤T细胞的方法及其应用。提供了一种体外扩增冷冻保存的淋巴结抗肿瘤T细胞的方法及淋巴结T细胞在治疗肿瘤中的应用。本发明专利技术提供的方法更简单，只需一次扩增培养可达到治疗的有效剂量，细胞增殖倍数更高，培养周期更短；本发明专利技术提供的淋巴结T细胞对肿瘤具有更好的治疗效果，具有广阔的应用前景。具有广阔的应用前景。具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种体外扩增冷冻保存的淋巴结抗肿瘤T细胞的方法及其应用


[0001]本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种体外扩增冷冻保存的淋巴结抗肿瘤T细胞的方法及其应用。

技术介绍

[0002]2018年全球恶性肿瘤新发病例数为1810万，死亡960万，成为全球第二大死因，仅次于心脑血管疾病。近年来，我国人民疾病谱发生巨大的变化，恶性肿瘤的发病率和死亡率明显上升，已经超越心脑血管疾病，成为我国第一大死因。
[0003]众所周知，肿瘤的发生和发展不仅取决于肿瘤细胞基因突变，还取决于它们与肿瘤微环境(Tumor microenvironment，TME)的相互作用，如缺氧、慢性炎症，特别是与免疫系统的相互作用。近年研究发现，免疫检查点抑制剂可以恢复肿瘤微环境中T细胞杀灭肿瘤细胞功能，显著延长患者的生存时间，开创肿瘤治疗的新模式。根据细胞分类来看，包括CAR
‑
T细胞疗法、TIL细胞疗法、TCR
‑
T细胞疗法等，其中研究最广泛的是TIL细胞疗法。
[0004]但是未见将淋巴结T细胞应用于治疗肿瘤的报道。

技术实现思路

[0005]为弥补现有技术的不足，本专利技术提供了一种体外扩增冷冻保存的淋巴结抗肿瘤T细胞的方法及淋巴结T细胞在治疗肿瘤中的应用。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]本专利技术的第一方面提供了一种体外扩增淋巴结抗肿瘤T细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
[0008]1)活化淋巴结单细胞；/>[0009]2)扩增淋巴结单细胞。
[0010]进一步，步骤1)包括使淋巴结单细胞与激活剂、生长因子和Feeder cell接触以活化淋巴结单细胞。
[0011]进一步，所述激活剂包括CD80、CD86、B7
‑
H3、4
‑
1BBL、CD27、CD30、CD134、B7h、CD40、LIGHT和/或它们的功能活性片段。
[0012]进一步，所述激活剂包括以下组的一种或多种靶点的激动剂：CD3、CD28、HVEM、CD40L、OX40和4
‑
1BB。
[0013]进一步，所述激活剂包括CD3激动剂和/或CD28激动剂。
[0014]进一步，所述激活剂选自CD3激动剂。
[0015]进一步，所述CD3激动剂包括CD3抗体和/或其抗原结合片段。
[0016]进一步，所述CD3激动剂选自CD3抗体。
[0017]进一步，所述CD3抗体包括OKT3、UHCT1。
[0018]进一步，所述CD3抗体选自OKT3。
[0019]进一步，所述生长因子包括白细胞介素、γ干扰素。
[0020]进一步，所述生长因子选自白细胞介素。
[0021]进一步，所述白细胞介素包括IL
‑
2、IL
‑
7、IL
‑
12、IL
‑
15、IL
‑
21。
[0022]进一步，所述白细胞介素选自IL
‑
2。
[0023]进一步，所述Feeder cell包括PBMC、树突状细胞、抗原呈递细胞。
[0024]进一步，所述Feeder cell选自PBMC。
[0025]进一步，所述PBMC为经过辐照的PBMC。
[0026]进一步，所述Feeder cell的辐照剂量为20
‑
60Gy。
[0027]进一步，所述淋巴结单细胞与Feeder cell比例为1：2
‑
1：200。
[0028]进一步，所述淋巴结单细胞与Feeder cell为1：50
‑
1：200。
[0029]进一步，步骤1)的细胞密度为1
‑6×
106cells/mL。
[0030]进一步，步骤2)包括对活化后的淋巴结单细胞进行补液以扩增淋巴结单细胞。
[0031]进一步，所述补液中添加有生长因子。
[0032]进一步，所述生长因子包括白细胞介素、γ干扰素。
[0033]进一步，所述生长因子选自白细胞介素。
[0034]进一步，所述白细胞介素包括IL
‑
2、IL
‑
7、IL
‑
12、IL
‑
15、IL
‑
21。
[0035]进一步，所述白细胞介素选自IL
‑
2。
[0036]进一步，所述淋巴结单细胞包括冷冻保存的淋巴结单细胞或新鲜的淋巴结单细胞。
[0037]进一步，所述淋巴结单细胞选自冷冻保存的淋巴结单细胞。
[0038]进一步，所述的扩增的总培养天数达到17天或细胞数大于1
×
109cells时终止培养。
[0039]本专利技术的第二方面提供了一种淋巴结T细胞冻存液，所述淋巴结T细胞冻存液包括冻存液A、冻存液B或冻存液C。
[0040]进一步，所述冻存液A、B包括CS10、生理盐水和人血白蛋白。
[0041]进一步，所述冻存液A包括50％CS10、40％生理盐水和10％的人血白蛋白。
[0042]进一步，所述冻存液B包括50％CS10、25％生理盐水和25％的人血白蛋白。
[0043]进一步，所述冻存液C包括羟乙基淀粉、DMSO和人血白蛋白。
[0044]进一步，所述冻存液C包括40％～70％羟乙基淀粉、3％～10％DMSO和20％～40％人血白蛋白。
[0045]本专利技术的第三方面提供了淋巴结T细胞群，所述淋巴结T细胞群由本专利技术第一方面所述的方法获得。
[0046]进一步，所述的淋巴结T细胞群包括具有增加的TCR克隆、增加的T细胞活化表型、降低的T细胞耗竭表型和/或增加的IFN
‑
γ的释放量的T细胞。
[0047]进一步，所述的增加的T细胞活化表型包括CD28 T细胞亚群和/或CD69 T细胞亚群。
[0048]进一步，所述的降低的T细胞耗竭表型包括TIGIT T细胞亚群和/或LAG3 T细胞亚群。
[0049]本专利技术的第四方面提供了本专利技术第三方面所述的淋巴结T细胞群在制备治疗肿瘤
药物中的应用。
[0050]进一步，所述肿瘤包括液体肿瘤、实体瘤。
[0051]进一步，所述肿瘤选自实体瘤。
[0052]本专利技术的第五方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括本专利技术第三方面所述的淋巴结T细胞群。
[0053]进一步，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。
[0054]本专利技术的第六方面提供了一种淋巴结T细胞的冻存方法，所述方法包括将淋巴结T细胞加入到本专利技术第二方面所述的淋巴结T细胞冻存液中。
[0055]进一步，所述淋巴结T细胞的冻存密度为0.5
‑5×
108cells/本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种体外扩增淋巴结抗肿瘤T细胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1)活化淋巴结单细胞；2)扩增淋巴结单细胞；优选的，步骤1)包括使淋巴结单细胞与激活剂、生长因子和Feeder cell接触以活化淋巴结单细胞；优选的，所述激活剂包括CD80、CD86、B7
‑
H3、4
‑
1BBL、CD27、CD30、CD134、B7h、CD40、LIGHT和/或它们的功能活性片段；优选的，所述激活剂包括以下组的一种或多种靶点的激动剂：CD3、CD28、HVEM、CD40L、OX40和4
‑
1BB；优选的，所述激活剂包括CD3激动剂和/或CD28激动剂；优选的，所述激活剂选自CD3激动剂；优选的，所述CD3激动剂包括CD3抗体和/或其抗原结合片段；优选的，所述CD3激动剂选自CD3抗体；优选的，所述CD3抗体包括OKT3、UHCT1；优选的，所述CD3抗体选自OKT3；优选的，所述生长因子包括白细胞介素、γ干扰素；优选的，所述生长因子选自白细胞介素；优选的，所述白细胞介素包括IL
‑
2、IL
‑
7、IL
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12、IL
‑
15、IL
‑
21；优选的，所述白细胞介素选自IL
‑
2。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Feeder cell包括PBMC、树突状细胞、抗原呈递细胞；优选的，所述Feeder cell选自PBMC；优选的，所述PBMC为经过辐照的PBMC；优选的，所述Feeder cell的辐照剂量为20
‑
60Gy；优选的，所述淋巴结单细胞与Feeder cell比例为1：2
‑
1：200；优选的，所述淋巴结单细胞与Feeder cell为1：50
‑
1：200。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)的细胞密度为1
‑6×
106cells/mL。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)包括对活化后的淋巴结单细胞进行补液以扩增淋巴结单细胞；优选的，所述补液中添加有生长因子；优选的，所述生长因子包括白细胞介素、γ干扰素；优选的，所述生长因子选自白细胞介素；优选的，所述白细胞介素包括IL<...

【专利技术属性】
技术研发人员：王璐，李孝阳，唐景玲，杨远，杨毓举，
申请(专利权)人：贵州生诺生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：