一种DNA/RNA混合物的处理方法技术

本申请提供一种DNA/RNA混合物的处理方法，属于生物技术领域。该方法通过提前消化DNA/RNA混合物样本中的部分DNA，能够有效提高DNA/RNA总核酸样本共建库中RNA的检出率，有利于RNA病原的检测和mNGS结果的解析。于RNA病原的检测和mNGS结果的解析。于RNA病原的检测和mNGS结果的解析。

【技术实现步骤摘要】
一种DNA/RNA混合物的处理方法


[0001]本申请涉及生物
，具体涉及一种DNA/RNA混合物的处理方法。

技术介绍

[0002]感染性疾病是临床常见疾病之一，多为细菌、病毒和真菌等病原体及其产物引起的局部或全身性炎症或器官功能障碍，具有较大的危害性和较高的病死率。感染是急危重症患者死亡的主要原因之一。重症感染起病急、进展快、病原体复杂，短时间内能否明确致病病原微生物至关重要。
[0003]宏基因组高通量测序(metagenomics NGS，mNGS)目前在病原微生物感染检测方面的应用如火如荼，特别是对新发的未知感染源检测特别有效，如新冠肺炎感染，最初就是通过mNGS技术来确诊了感染源是一种新型的冠状病毒。感染相关的病原微生物种类繁多，不过以遗传物质来分类的话，可以分为RNA和DNA病原微生物。常规的mNGS检测一次只能针对一种核酸类型的微生物，比如细菌类的感染病例(肺炎支原体、结核分歧杆菌等)或者RNA病毒类(冠状病毒、艾滋病毒等)的案例。然后在实际的感染病例确诊过程中，特别是对于疑难的新发病例诊断，往往连病原微生物的基本信息都难以获得，换言之无法确认是DNA还是RNA来源的微生物。这时候，如果能同时进行基因组(DNA)和转录组(RNA)建库测序，那必然可以加速感染源的定位。
[0004]DNA建库常见方法是双链建库，DNA经过末端补平，加A尾后通过连接的方法加上测序接头完成建库。RNA则是在测序前需要经过逆转录，形成一链cDNA，二链后类似双链DNA后再建库。如果需要对DNA及RNA同时进行检测，一般需要对DNA、RNA分别提取后，分别建库。如果能使DNA、RNA共同建库，共同检测，可以节约样本，单一样本通过总核酸提取后，可以同时对DNA、RNA建库并获得两者遗传信息，因此可以达到节约样本的目的。另一方面，总核酸共同建库可以更加灵敏地获得遗传信息。例如在宏基因组(mNGS)检测中，可以同时检测DNA病毒及RNA病毒，提高了检测效率。在肿瘤检测中，如果同时检测DNA及RNA，不仅可以有效检测突变，插入/缺失突变(Indel)更可以在RNA水平检测出融合和基因跳跃，RNA表达差异等，临床意义巨大。因此，DNA、RNA共测序成为目前技术攻坚对象。
[0005]DNA/RNA共建库是一种比较前沿的技术，相关的文献报道很少。鉴于感染中病原微生物RNA/DNA共提取的难度大、复杂性高、DNA和RNA丰度差异大等问题，要想实现DNA/RNA共建库，本身就是一个不小的挑战。目前仅有的DNA/RNA共建库报道中RNA建库部分还是使用了传统的RNA建库原理，即先进行RNA逆转录生产cDNA第一链，而后利用RNase H和DNA聚合酶I合成双链cDNA。最后，体系中原有的基因组DNA和后生成的双链cDNA就可以进行常规的DNA建库方案，一般为片段化酶法和转座酶法建库。该方案存在一些缺点，例如RNA病毒本身含量低且稳定性较差，在多轮实验操作过程中损耗严重，极易因达不到检出限而出现漏检。对于微量DNA/RNA的建库效率低，如从痰液、口拭子、肺泡灌洗液等感染类样本中共提取的DNA/RNA样本。

技术实现思路

[0006]本申请的目的在于提供一种DNA/RNA混合物的处理方法。
[0007]本申请的专利技术人发现，通过共提取获得的临床DNA/RNA混合样本共建库后，得到的测序结果中DNA的数据偏多，RNA数据少而检出率低，对临床上mNGS的结果解析难度很大。尤其是针对本身含量就较少的病毒RNA样本，检出率低会造成漏检的情况，对临床的判断带来很大的困难，因此提高共提取样本用于共建库时的RNA检出是很有必要的，有利于mNGS的检测。
[0008]由于真实核酸共提取样本中DNA和RNA的比例不是固定值，通过模拟提取样本中不同的DNA和RNA的比例，使用含有不同质量比的DNA和RNA(9：1，5：1，1：1)的混合样本进行共建库并测序。若先消化DNA/RNA共提取混合物中的一部分DNA，将消化后的DNA/RNA混合物中的RNA进行逆转录，在片段化前将剩余DNA掺入，可提高RNA的检出，且消化DNA的比例越高，RNA的检出越多，对低丰度的RNA病原灵敏度提高。
[0009]本申请的第一方面提供一种DNA/RNA混合物的处理方法，所述方法包括：
[0010](1)获得DNA/RNA混合物；
[0011](2)将DNA/RNA混合物按照N:1的比例分为样本a和样本b，其中N是大于等于2的常数，所述比例可以是体积比、质量比或摩尔比，优选质量比；
[0012](3)消化样本a中的DNA得到DNA含量减少的DNA/RNA混合物或基本不含DNA的RNA混合物；
[0013]任选地，纯化或者不纯化上述消化产物；
[0014](4)将DNA含量减少的DNA/RNA混合物或基本不含DNA的RNA混合物进行逆转录，合成cDNA一链；
[0015]任选地，在cDNA一链合成之后再合成cDNA二链；
[0016](5)将步骤(4)的产物与样本b混合。
[0017]在一些实施方案中，所述方法采用核酸酶消化样本a中的DNA。在一些实施方案中所述核酸酶是DNA内切酶，例如核酸内切酶dsDNase、T7核酸内切酶、核酸内切酶Vvn或核酸内切酶DNaseⅠ、核酸内切酶DNaseⅡ中的一种或多种，优选核酸内切酶DNaseⅠ。
[0018]在一些实施方案中，所述核酸酶是一切具有消化单链或双链DNA功能的酶，且所述核酸酶不消化RNA。
[0019]在一些实施方案中，N是大于等于2的常数，例如2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.2、5.5、5.8、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5。
[0020]在一些实施方案中，所述N是大于19的常数，例如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、45、46、47、48、49、50。
[0021]在一些实施方案中，所述逆转录过程使用M
‑
MLV逆转录酶或AMV逆转录酶，优选M
‑
MLV逆转录酶。
[0022]在一些实施方案中，所述逆转录过程使用的引物是Oligo(dT)或随机六聚体，优选随机六聚体。
[0023]在一些实施方案中，所述DNA/RNA混合物是经过共提取获得的，例如磁珠法，层析
柱法和有机溶剂法。
[0024]在一些实施方案中，所述DNA/RNA混合物中的DNA的质量大于等于RNA的质量本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种DNA/RNA混合物的处理方法，其特征在于，所述方法包括：(1)获得DNA/RNA混合物；(2)将所述混合物按照N:1的比例分为样本a和样本b，其中N是大于等于2的常数；(3)消化样本a中的DNA得到DNA含量减少的DNA/RNA混合物或基本不含DNA的RNA混合物；任选地，纯化或者不纯化上述消化产物；(4)将DNA含量减少的DNA/RNA混合物或基本不含DNA的RNA混合物进行逆转录，合成cDNA一链；任选地，在cDNA一链合成之后再合成cDNA二链；(5)将步骤4的产物与样本b混合。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法采用核酸酶消化样本a中的DNA，优选DNA内切酶，更优选DNaseⅠ。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述N小于等于25，优选小于等于24，更优选小于等于23，更优选小于等于22，更优选小于等于21，更优选小于等于20，最优选小于等于19。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述逆转录过程使用随机六聚体引物。5.根据权利要求1
‑
4任一项所述的方法，其特征在于，所述DNA/RNA混合物中的DNA的质量大于等于RNA的质量。6.根据权利要求1
‑
4任一项所述的方法，其特征在于，所述DNA/RNA混合物中的DNA的摩尔量大于等于RNA的摩尔量。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述DNA/RNA混合物是经过共提取获得的，优选磁珠法共提取。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对步骤(4)的产物进行纯化，优选磁珠纯化。9.一种提高DNA/RNA共建库方法，所述方法包括：(1)使用权利要求1
‑
8任一项所述的方法处理DNA/RNA混合物样本，得到总核酸样本；(2)任选地，纯化得到的总核酸样本；(3)将总核酸样本与转座酶复合物孵育，得到片段化的核酸样本；(4)加入带有接头序列的引物，通过PCR扩增得到带有接头的核酸片段；(5)任选地，对扩增产物进行纯化。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述转座酶复合物包括转座酶和转座酶识别核心序列(ME序列)，优选地，所述转座酶是Tn5转座酶。11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述转座酶复合物还包括标签序列。12.根据权利要求11所述的方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹林，聂俊伟，瞿志鹏，张力军，江明扬，郑晓敏，安莹杰，
申请(专利权)人：南京诺唯赞生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：