一种增强脐带间充质干细胞抗纤维化能力的培养方法及其应用技术

本发明专利技术属于干细胞培养技术领域，特别涉及一种增强脐带间充质干细胞抗纤维化能力的培养方法及其应用。具体为复苏P1代次的脐带间充质干细胞，经传代培养，待细胞汇合度达到60%~70%后，用无菌的D

【技术实现步骤摘要】
一种增强脐带间充质干细胞抗纤维化能力的培养方法及其应用


[0001]本专利技术属于干细胞培养
，特别涉及一种增强脐带间充质干细胞抗纤维化能力的培养方法及其应用。

技术介绍

[0002]肝纤维化是所有慢性肝病和反复性肝损伤的必经之路。出现肝纤维化后，若得不到积极的治疗和监测，便会进一步发展为肝硬化，最终可能导致肝癌。肝脏疾病因其发病率高和波及面广，已成为全球瞩目的问题。但是目前除了肝移植外没有有效的治疗方法，然而供体短缺、高昂的医疗费用以及长期需靠免疫抑制剂来预防排斥反应等一系列问题仍然是肝移植的主要局限条件。
[0003]一些基础和临床研究表明，间充质干细胞能够延缓肝纤维化进程，具备治疗肝病的能力。间充质干细胞包括骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞和脐带间充质干细胞等，其中脐带间充质干细胞以其可提取细胞数量巨大、免疫原性更低、无致瘤性、取材方便及不受伦理限制等优势，成为治疗使用的首选。
[0004]研究表明，间充质干细胞在治疗肝纤维化过程中，旁分泌是其主要作用方式之一。但由于在常规条件下，间充质干细胞旁分泌能力相对有限，并且输注后通常出现一部分细胞死亡的情况，使其功能大打折扣。目前，研究人员为提高间充质干细胞治疗潜能，采用了一些技术，如通过支架材料共移植或用转染的方式对间充质干细胞进行基因修饰，这些技术虽能一定程度的提高间充质干细胞的治疗能力，但存在安全隐患，增加了间充质干细胞输注后的风险。总之，当前急需一种安全性较高的增强间充质干细胞抗纤维化能力的方法。
[0005]TNF
‑
β作为肿瘤坏死因子家族重要的一员，一种重要的抗炎因子，在间充质干细胞治疗肝病过程中，通过旁分泌途径二者相互影响。目前尚未有通过TNF
‑
β诱导脐带间充质干细胞来提高其抗纤维化能力的报道。

技术实现思路

[0006]针对现有技术中存在的问题，本专利技术提供了一种能够增强脐带间充质干细胞抗纤维化能力的培养方法，该方法能够显著提高抗纤维化相关的细胞因子分泌水平。
[0007]本专利技术还提供了上述培养方法在培养提高抗纤维化能力的脐带间充质干细胞中的应用。
[0008]本专利技术为了实现上述目的所采用的技术方案为：本专利技术提供了一种能够增强脐带间充质干细胞抗纤维化能力的培养方法，包括以下步骤：（1）复苏P1代次的脐带间充质干细胞至培养瓶中；（2）消化P2代细胞，将培养瓶中P2代脐带间充质干细胞进行传代培养；（3）待培养瓶中细胞的汇合度达到标准之后，弃原培养基，用无菌的不含有Mg
2+
和
Ca
2+
的D
‑
PBS清洗细胞，将完全培养基更换为基础培养基进行培养；（4）培养结束后，用无菌的不含有Mg
2+
和Ca
2+
的D
‑
PBS清洗细胞，将基础培养基更换为含有TNF
‑
β的培养基继续培养。
[0009]进一步的，步骤（1）中，脐带间充质干细胞的接种密度为8000
‑
10000 cells/cm2，细胞用量为6
×
105~7.5
×
10
5 cells；培养瓶中的培养基为完全培养基。
[0010]进一步的，步骤（1）中，所述复苏的温度为37℃。
[0011]进一步的，步骤（2）中，所述培养的时间为3d；所述传代的比例1:3。
[0012]进一步的，步骤（3）中，所述汇合度的标准为60%~70%。
[0013]进一步的，步骤（3）中，所述培养的时间为24h。
[0014]进一步的，步骤（4）中， 所述TNF
‑
β在培养基中的浓度为90ng/ml。
[0015]进一步的，步骤（4）中，所述培养的时间为24h。
[0016]本专利技术还提供了一种利用上述培养方法得到的脐带间充质干细胞在抑制肝星状细胞纤维化相关的蛋白分泌中的应用。
[0017]本专利技术提供的培养方法，培养后收集上清和细胞，发现上清中抗纤维化细胞因子HGF、IL
‑
10浓度显著增加以及胞内抗纤维化细胞因子HGF、IL
‑
10表达丰度显著提高；经未进行TNF
‑
β诱导处理的脐带间充质干细胞和90ng/ml TNF
‑
β诱导处理过的脐带间充质干细胞分别与肝星状细胞共培养，发现后者肝星状细胞中α
‑
SMA蛋白表达量有所降低；在构建的肝纤维化大鼠模型中，用未经TNF
‑
β诱导处理的脐带间充质干细胞和90ng/ml TNF
‑
β诱导处理过的脐带间充质干细胞分别对大鼠进行治疗，发现与模型对照组相比，两者肝纤维化程度均有明显的改善，且后者的治疗效果更好。本专利技术提供的这种培养方法能有效提高脐带间充质干细胞分泌抗纤维化因子的水平，从而增强了其抗纤维化的能力。
[0018]本专利技术的有益效果为：（1）本专利技术通过因子TNF
‑
β对脐带间充质干细胞的作用处理，该细胞的旁分泌功能被活化，抗纤维化相关的细胞因子分泌水平显著提高，从而获得更强的抗纤维化能力。
[0019]（2）相对于现有的技术而言，本专利技术不涉及基因修饰、外源支架材料和任何可能存在毒副作用的化学药物，操作简便且安全性高。
附图说明
[0020]图1是未经TNF
‑
β诱导处理的脐带间充质干细胞和90ng/ml TNF
‑
β诱导处理过的脐带间充质干细胞分泌到胞外的抗纤维化细胞因子HGF、IL
‑
10浓度的比较（*表示P＜0.05，差异显著；**表示P＜0.01，差异极显著）。
[0021]图2是未经TNF
‑
β诱导处理的脐带间充质干细胞和90ng/ml TNF
‑
β诱导处理过的脐带间充质干细胞胞内抗纤维化细胞因子HGF、IL
‑
10表达丰度的比较（*表示P＜0.05，差异显著；**表示P＜0.01，差异极显著）。
[0022]图3是肝星状细胞单独培养后、未经TNF
‑
β诱导处理的脐带间充质干细胞和肝星状细胞共培养后以及90ng/ml TNF
‑
β诱导处理过的脐带间充质干细胞和肝星状细胞共培养后，肝星状细胞中α
‑
SMA蛋白表达量的比较。
[0023]图4是在大鼠肝纤维化模型中，大鼠肝脏纤维化程度的组织病理学HE染色结果比较，其中A为正常对照组、B为模型对照组、C为治疗组（未诱导）、D为治疗组（诱导处理）。
[0024]图5是在大鼠肝纤维化模型中，大鼠肝脏纤维化程度的组织病理学Masson染色结果比较，其中A为正常对照组、B为模型对照组、C为治疗组（未诱导）、D为治疗组（诱导处理）。
[0025]图6是结合Masson染色结果，对各组肝纤维化面积的分析以及组间比较。其中contr本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种能够增强脐带间充质干细胞抗纤维化能力的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）复苏P1代次的脐带间充质干细胞至培养瓶中；（2）消化P2代细胞，将培养瓶中P2代脐带间充质干细胞进行传代培养；（3）待培养瓶中细胞的汇合度达到标准之后，弃原培养基，用无菌的不含有Mg
2+
和Ca
2+
的D
‑
PBS清洗细胞，将完全培养基更换为基础培养基进行培养；（4）培养结束后，用无菌的不含有Mg
2+
和Ca
2+
的D
‑
PBS清洗细胞，将基础培养基更换为含有TNF
‑
β的培养基继续培养。2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤（1）中，脐带间充质干细胞的接种密度为8000
‑
10000 cells/cm2，细胞用量为6
×
105~7.5<...

【专利技术属性】
技术研发人员：王金坡，马贺然，谭毅，
申请(专利权)人：银丰生物工程集团有限公司，
类型：发明
国别省市：