一种高效创制不育合成新多倍体鲫鱼的方法技术

本发明专利技术涉及一种高效创制不育合成新多倍体鲫鱼的方法，包括S1.父本双二倍体红鲫与母本双三倍体银鲫繁殖获得子代G1，从G1中筛选可育双四倍体雄鱼；S2.以可育双四倍体雄鱼为父本，与双二倍体红鲫雌鱼回交获得新双三倍体子代G2；S3.从双三倍体子代G2筛选能够直接整合精核基因组类型的双三倍体雌鱼，并将其卵子与紫外线灭活的兴国红鲤精子受精，获得大量人工雌核生殖保持系G3；S4.以人工雌核生殖保持系G3为母本，与团头鲂等二倍体雄鱼杂交，获得合成新多倍体子代G4。本发明专利技术提供的育种方法能够大规模创制不育的合成新多倍体，从而为鲫鱼种质创新提供大量的种质资源，是一条非常有潜力的育种途径。的育种途径。的育种途径。

【技术实现步骤摘要】
一种高效创制不育合成新多倍体鲫鱼的方法


[0001]本专利技术涉及鱼类遗传育种
，具体涉及一种高效创制不育合成新多倍体鲫鱼的方法。
技术背景
[0002]多倍化育种技术是目前最经典、且卓有成效的细胞工程育种技术。多倍化育种技术已被广泛地运用于鱼类遗传育种中。在鱼类中有很多天然的或人工合成的多倍体已被广泛揭示具有多种优良性状，例如双三倍体银鲫、三倍体虹鳟等。杂交育种技术是另外一种经典的细胞工程育种技术。通过种内或种间杂交整合两个物种的基因组，后代在外形、抗病能力等方面均可能表现出一定的杂种优势。杂交育种仍然是目前鱼类新品种培育的主要途径，成功案例如将黑尾鲌与团头鲂杂交获得水产新品种“先锋1号”，将瓦氏黄颡鱼与江黄颡鱼杂交培育的水产新品种“全优1号”等。此外，多倍化和杂交均可能导致子代不育或者育性严重降低。由于能量不需要额外提供给性腺发育，很多不育的鱼具有生长快，出肉率高的优势。同时，育性丧失还可以消除不必要的繁殖，避免人工养殖品种逃逸到自然水域后对天然群体的遗传结构产生破坏。因此将多倍化育种与杂交育种技术结合，发展新型的育种技术，创制不育的优良种质，为新品种培育提供核心育种材料，仍然是鱼类遗传育种的重要方向。
[0003]鲫鱼是我国重要的大宗淡水养殖鱼类之一，也是国人餐桌上最常见的食用鱼之一，近几年鲫鱼的年总产量已接近300万吨。在天然群体中，鲫鱼包括拥有100条染色体的双二倍体鲫(Carassius auratus)(也可称为异源四倍体AABB)以及拥有超过150条染色体的双三倍体银鲫(Carassius gibelio)(也可称为异源六倍体AAABBB)。双二倍体鲫是典型行有性生殖的物种，其雌雄性比为1:1，雌雄个体经过正常减数分裂后形成染色体数量减半的配子，随后经过精卵融合形成双二倍体受精卵。双三倍体银鲫具有天然单性雌核生殖的能力，银鲫卵子在成熟过程中第一次减数分裂被抑制，因此形成不减数的双三倍体卵子。精子与银鲫卵子受精后，精核一般不解凝，仅激活卵核进入胚胎发育过程。有意思的是，极少数的精核进入银鲫卵子后，不仅会发生解凝，还会与卵核融合形成更高倍性的合成新多倍体，但是这种情况自然发生的概率非常低。例如兴国红鲤(AABB)精子与银鲫卵子受精，大约只有0.3％
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0.5％的红鲤精核会在银鲫卵核中自然解凝，并整入银鲫基因组形成合成双四倍体鲤鲫(AAAABBBB)。这种合成双四倍体鲤鲫在基因组组成上包含三套鲫鱼基因组和一套鲤鱼基因组，因此在外形上更接近鲫鱼。同时由于一套鲤鱼基因组的整入，合成双四倍体鲤鲫还具有生长快和抗病力强的优势。
[0004]因此利用银鲫整合父源基因组培育新品种是一条非常有潜力的鲫鱼育种途径。然而依赖精核偶发整入银鲫卵核的几率非常低，这也导致筛选和鉴定合成多倍体的工作量极大且效率极低。如何高效创制不育合成新多倍体鲫鱼仍然是目前鲫鱼品种改良以及新品种培育的关键技术瓶颈。

技术实现思路

[0005]为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供了一种高效创制不育合成新多倍体鲫鱼的方法。
[0006]本专利技术采用了以下技术方案：
[0007]一种高效创制不育合成新多倍体鲫鱼的方法，包括以下步骤：
[0008]S1.创制可育双四倍体鲫：父本双二倍体红鲫与母本双三倍体银鲫繁殖获得子代G1，从G1中筛选可育双四倍体雄鱼；
[0009]S2.创制新双三倍体群体：以可育双四倍体雄鱼为父本，与双二倍体红鲫雌鱼回交获得新双三倍体子代G2；
[0010]S3.筛选及扩群：从双三倍体子代G2中筛选出能够直接整合精核基因组类型的雌鱼，并将其卵子与紫外线灭活的兴国红鲤精子受精，获得人工雌核生殖保持系G3；
[0011]S4.创制合成新多倍体：以人工雌核生殖保持系G3为母本，与不同类型的雄鱼杂交，获得合成新多倍体子代G4。
[0012]优选的，所述步骤S1中，母本双三倍体银鲫使用异育银鲫“中科3号”。
[0013]优选的，所述步骤S1中，繁殖的具体方法为：在鲫鱼繁殖季节，将父本精液以精液：胰蛋白酶溶液体积比为1：20进行混合，25℃下处理精液20min；取母本卵子与处理后的精液混合受精，所得受精卵继续孵化；所述胰蛋白酶溶液的浓度为1％。
[0014]优选的，所述步骤S1中，G1代包括双三倍体银鲫和双四倍体鲫，其筛选的具体方法为：
[0015]S11.将G1代养殖至性成熟后，剪鳍条采微量血，通过测定每尾个体血细胞的DNA含量，先筛选出四倍体子代；
[0016]S12.在S11筛选的四倍体子代，挑选出雄鱼并取精液，将取得的雄鱼精液分别与双二倍体鲫雌鱼卵子受精，根据受精卵孵化率最终筛选得到所述可育双四倍体雄鱼。
[0017]优选的，所述步骤S11中，将采集到的血加入CyStain DNA 1Step溶液后迅速混合，再利用流式细胞仪测定血细胞的DNA含量。
[0018]优选的，微量血为0.1～0.5μL；步骤S12中，受精卵孵化率＞10％，则雄鱼为可育双四倍体雄鱼。
[0019]优选的，所述步骤S3中，筛选能够直接整合精核基因组类型的雌鱼的具体方法为：
[0020]S31.挑选性成熟的兴国红鲤雄鱼并取精液，用精子保存液按体积比为1：50对精液进行稀释，将4ml稀释后的精液加入直径为10cm的培养皿中，晃动培养皿并在40W紫外灯下20cm处照射6～8min，获得紫外线灭活的精子；
[0021]S32.从新双三倍体子代G2中挑选出性成熟的雌性亲本，将其卵子分别同时与正常以及紫外线灭活的兴国红鲤精子受精，检测与两种精子受精所形成胚胎G3的倍性；判断新双三倍体雌鱼生殖方式的具体标准为：当新双三倍体雌鱼卵子与紫外线灭活精子受精形成双三倍体胚胎，与正常精子受精形成双四倍体胚胎，则判定产生该新双三倍体雌鱼卵子的雌鱼为能够直接整合精核基因组类型的雌鱼。
[0022]优选的，所述步骤S32中，检测胚胎G3倍性的方法为：
[0023]S321.待G3胚胎发育至体节期，随机挑选100枚受精卵，混合后吸干多余水分，加入CyStain DNA1Step溶液，并在溶液中将胚胎剪碎；
[0024]S322.剪碎的胚胎过300目滤网后获得细胞悬液，利用流式细胞仪测定所述细胞悬液中混合胚胎细胞的DNA含量。
[0025]优选的，所述步骤S4中，不同类型的雄鱼为二倍体团头鲂、草鱼、花鲢、白鲢、翘嘴鲌中的任意一种。
[0026]本专利技术的有益效果在于：
[0027]银鲫卵核会偶发整合精核基因组，形成包含三套鲫鱼基因组与一套父本基因组的更高倍性的合成新多倍体，但是这种情况自然发生的概率非常低。虽然通过一定浓度的胰酶处理雄鱼精液再与银鲫卵子受精，后代中可能出现较高比例(5％
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20％)的合成多倍体。但胰酶处理会极大影响精子的受精能力，致使受精率低于5％，因此获得合成多倍体的实际概率最高也只能达到约1％，从而无法通过该方法获得大量的合成多倍体。并且不同类型雄鱼的精液耐受胰酶处理的最本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高效创制不育合成新多倍体鲫鱼的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.创制可育双四倍体鲫：父本双二倍体红鲫与母本双三倍体银鲫繁殖获得子代G1，从G1中筛选可育双四倍体雄鱼；S2.创制新双三倍体群体：以可育双四倍体雄鱼为父本，与双二倍体红鲫雌鱼回交获得新双三倍体子代G2；S3.筛选及扩群：从双三倍体子代G2中筛选出能够直接整合精核基因组类型的雌鱼，并将其卵子与紫外线灭活的兴国红鲤精子受精，获得人工雌核生殖保持系G3；S4.创制合成新多倍体：以人工雌核生殖保持系G3为母本，与不同类型的雄鱼杂交，获得合成新多倍体子代G4。2.如权利要求1所述的一种高效创制不育合成新多倍体鲫鱼的方法，其特征在于，所述步骤S1中，母本双三倍体银鲫使用异育银鲫“中科3号”。3.如权利要求1所述的一种高效创制不育合成新多倍体鲫鱼的方法，其特征在于，所述步骤S1中，繁殖的具体方法为：在鲫鱼繁殖季节，将父本精液以精液：胰蛋白酶溶液体积比为1：20进行混合，25℃下处理精液20min；取母本卵子与处理后的精液混合受精，所得受精卵继续孵化；所述胰蛋白酶溶液的浓度为1％。4.如权利要求1所述的一种高效创制不育合成新多倍体鲫鱼的方法，其特征在于，所述步骤S1中，G1代包括双三倍体银鲫和双四倍体鲫，其筛选的具体方法为：S11.将G1代养殖至性成熟后，剪鳍条采微量血，通过测定每尾个体血细胞的DNA含量，先筛选出四倍体子代；S12.在S11筛选的四倍体子代，挑选雄鱼并取精液，将取得的雄鱼精液分别与双二倍体鲫雌鱼卵子受精，根据受精卵孵化率最终筛选得到所述可育双四倍体雄鱼。5.如权利要求4所述的一种高效创制不育合成新多倍体鲫鱼的方法，其特征在于，所述步骤S11中，将采集到的血加入CySt...

【专利技术属性】
技术研发人员：桂建芳，鲁蒙，周莉，汪洋，王忠卫，李志，张勤灿，朱子域，李熙银，张晓娟，
申请(专利权)人：中国科学院水生生物研究所，
类型：发明
国别省市：