一种鼠源lgG单克隆抗体及其制备方法、应用技术

本发明专利技术涉及免疫学技术领域，尤其涉及一种鼠源lgG单克隆抗体及其制备方法、应用。该单克隆抗体的重链可变区具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；其轻链可变区具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。本发明专利技术还公开了编码该抗体的DNA分子，表达该抗体以及被该表达载体转化的真核宿主细胞。本发明专利技术提供的鼠源IgG单克隆抗体在5L生物反应器进行了初步验证，表达量为5.33g/L。经鉴定，利用该单抗作为阻断剂评价，阻断效果明显，在阻断剂使用中发挥重大作用。在阻断剂使用中发挥重大作用。

【技术实现步骤摘要】
一种鼠源lgG单克隆抗体及其制备方法、应用


[0001]本专利技术涉及免疫学
，尤其涉及一种鼠源lgG单克隆抗体及其制备方法、应用。

技术介绍

[0002]阻断剂是一类用在体外诊断检测实验中，可以消除或降低免疫分析干扰的生物活性制剂。阻断剂在体外诊断检测上的应用可以有效地减少免疫分析干扰带来的假阳性或假阴性的错误检测结果。故在体外诊断领域，阻断剂应用较广且需求量较大。通常在体外诊断领域常选择在小鼠腹水中制备单克隆抗体，但对于需求量大的项目，腹水制备受限于场地和注射用小鼠，存在不易放大生产的问题。
[0003]随着生物制药行业在最近20年的迅速发展，特别是基于哺乳动物细胞表达的产品市场份额不断扩大，体外哺乳动物培养制备高表达单克隆抗体显得极为重要。而一株稳定高产的工程细胞株能显著增加单位体积产量，降低产品的生产成本。其中CHO细胞已进化为制造重组蛋白治疗药物的最典型的哺乳动物细胞系，由于其稳健性和相对较高的生产能力(从1到10g/L)而被广泛应用于生物
许多生物制药生产的CHO细胞系来源于CHO
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dg44、CHO
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DUKX
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B11、CHO
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S和CHO
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K1细胞系。CHO
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S细胞系是一种稳定的非整倍体细胞系，其工作原理是基于二氢叶酸还原酶(DHFR)筛选平台，尽管该野生型细胞系具有基础水平的DHFR活性。使用基于增加嘌呤霉素和MTX水平的双相选择系统，以产生一个稳定的、能够产生高水平单抗的细胞池。然而目前研究中大多是关于人鼠嵌合抗体、人源化抗体或者全人源类IgG类抗体进行的研究探索。因此，利用CHO
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S细胞为宿主，构建高表达鼠源IgG单克隆抗体，且在5L反应器进行验证，对企业来说是极为迫切且有重要意义的。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术提供了一种鼠源lgG单克隆抗体及其制备方法、应用。利用该单抗作为阻断剂的阻断效果明显，在阻断剂使用中发挥重大作用，且制备方法简单，适于大量生产。
[0005]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0006]一种鼠源lgG单克隆抗体，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
[0007]本专利技术所述的鼠源lgG单克隆抗体，其特征在于，还包括重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区为鼠IgG1，所述轻链恒定区为鼠Kappa型。
[0008]本专利技术还提供了编码所述的鼠源lgG单克隆抗体的DNA分子。
[0009]其中，所述的DNA分子包括编码所述重链可变区的序列如SEQ ID NO:3所示或与SEQ ID NO:3互补的核苷酸，和编码所述轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示或与SEQ ID NO:4互补的核苷酸。
[0010]本专利技术还提供一种表达载体，含有编码所述的鼠源lgG单克隆抗体的DNA分子。
[0011]一些具体实施例中，本专利技术所述表达载体的骨架载体为pCHO1.0。
[0012]本专利技术还提供一种重组宿主，含有所述的表达载体。在一些具体实施例中，所述宿主细胞为CHO
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S细胞。
[0013]本专利技术还提供一种鼠源lgG单克隆抗体的制备方法，包括：
[0014](1)、构建含有权利要求3或4所述的DNA分子的表达载体；
[0015](2)、将步骤(1)所述的表达载体转化宿主细胞；
[0016](3)、培养步骤(2)所得的宿主细胞；
[0017](4)、分离纯化获得所述单克隆抗体。
[0018]本专利技术还提供了所述的鼠源lgG单克隆抗体在制备阻断剂或体外诊断试剂中的应用。
[0019]本专利技术还提供一种阻断剂包括所述的鼠源lgG单克隆抗体和可接受的助剂。
[0020]本专利技术还提供了所述的鼠源lgG单克隆抗体、所述的阻断剂在制备体外诊断试剂中的应用。
[0021]本专利技术提供的鼠源IgG单克隆抗体在5L生物反应器进行了初步验证，表达量为5.33g/L。经鉴定，利用该单抗作为阻断剂评价，阻断效果明显，在阻断剂使用中发挥重大作用。
附图说明
[0022]图1为质粒酶切验证图，a和b分别代表A
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pCHO1.0，XmaJI/BstZ17I酶切鉴定和EcoRV/PacI酶切鉴定；
[0023]图2单克隆Fed
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batch表达量；
[0024]图3为SDS
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PAGE和HPLC分析；(A)1：还原型条带(经还原剂β
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巯基乙醇/DTT处理)；2：非还原型条带；(B)：蓝色峰：Marker从左往右大小依次是：1340KDa，670KDa，300KDa，150KDa，45KDa，17KDa，1KDa；红色峰：目的蛋白HPLC色谱分析；
[0025]图4为在磁微粒G17项目上比较阻断剂单克隆抗体与对照腹水抗体的相关性。
具体实施方式
[0026]本专利技术提供了一种鼠源lgG单克隆抗体及其制备方法、应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。
[0027]本专利技术采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
[0028]下面结合实施例，进一步阐述本专利技术：
[0029]实施例1：表达载体的构建
[0030]按照5
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Full RACE试剂盒钓取实验室杂交瘤细胞株中目的基因，其重链可变区具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列和SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列，轻链可变区具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列和SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。以反转录的cDNA为模板，上游引物使用所调取的轻重链目的基因上游引物H1/L1，下游引物使用鼠IgG1恒定区下
游引物H2/L2扩增全长的重轻链目的基因全长序列；选择信号肽核苷酸序列为：
[0031]ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTC CAGGTTCCACTGGCGCC(SEQ ID NO:5)；信号肽对应氨基酸序列为：METDTLLLWVLLLWVPGSTGA(SEQ ID NO:6)。随后重、轻链全长基因分别通过XmaJI/BstZ17I和EcoRV/PacI酶切位点构建至实验室pCHO1.0载体中，命名为A
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pCH01.0。此构建过程中用到的引物如下：
[0032]H1：5
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cgCCTAGGGCCGCC本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鼠源lgG单克隆抗体，其特征在于，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。2.根据权利要求1所述的鼠源lgG单克隆抗体，其特征在于，还包括重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区为鼠IgG1，所述轻链恒定区为鼠Kappa型。3.编码权利要求1或2所述的鼠源lgG单克隆抗体的DNA分子。4.根据权利要求3所述的DNA分子，其特征在于，包括编码所述重链可变区的核酸和编码所述轻链可变区的核酸，所述核酸序列分别如SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4所示，或其互补序列。5.一种表达载体，其特征在于，含有权利要求3或4所述的DNA分子。6.一种重组宿主，...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔亚敏，王志强，周雷鸣，孙静静，田晓平，赵巧辉，李桂林，付光宇，杨增利，
申请(专利权)人：郑州伊美诺生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：