一种用于检测羧酸酯酶的荧光探针及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种用于检测羧酸酯酶的荧光探针及其制备方法和应用，属于检测探针技术领域，所述荧光探针的结构通式如式Ⅰ所示，其中R1为羟基、卤素、烷基或烷氧基的单取代；R2为识别基团。本发明专利技术提供的荧光探针以识别基团作为CEs的水解位点和淬灭剂连接到ENBS上。在与CEs反应后，ENBS的释放通过三个自发的步骤进行。这种生物转化导致ENBS的荧光发射急剧增加。同时，该探针可在激光照射下通过PDT产生对癌细胞具有高度毒性的活性氧(ROS)，达到综合诊疗的目的。的目的。的目的。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测羧酸酯酶的荧光探针及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于检测探针
，尤其涉及一种用于检测羧酸酯酶的荧光探针及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]肝细胞癌(HCC)是全球致死率第三高的恶性肿瘤，严重威胁人类生命和健康。一般认为，早期准确检测出HCC可改善患者的预后和生存。羧酸酯酶(Carboxylesterase,CEs)是一组多家族丝氨酸酯酶，能有效催化羧酸酯类、氨基甲酸酯类、酰胺类、硫酯类等外源物质的水解。特别是，CEs已被证明是HCC的重要生物标志物，因为其表达水平与恶性程度密切相关。因此，寻找一种具有高灵敏度和高特异性的CEs检测新方法可能是早期诊断肝脏疾病严重程度或存在的有效工具。
[0003]迄今为止，荧光探针以其灵敏度高、成本低、操作方便、时空分辨率高等独特特性在分子和细胞水平的生理病理监测中发挥着越来越重要的作用。小荧光探针一般由三部分组成：荧光基团、识别基团及连接链。荧光团通过激发而发射荧光信号以标记目标分子，识别基团与目标生物分子选择性结合，连接链用于连接识别基团与荧光团。因此，大量研究报道了用小荧光探针来检测羧酸酯酶。虽然使用可激活的荧光探针在检测CEs领域进行了一些研究，但CEs的主要识别部分仍然使用酯键，这可能会与乙酰胆碱酯酶(AChE)和丁酰胆碱酯酶(BChE)的底物存在潜在的相互干扰，从而干扰CEs活性的准确检测。
[0004]近年来，肿瘤诊疗一体化已成为肿瘤治疗的新途径。为了实现高效、精准、无创的治疗，一系列光敏剂(ps)被开发用于图像介导的光疗。尼罗蓝衍生物硫代尼罗蓝ENBS作为一种阳离子光敏剂，已经应用于光动力治疗。由于它能够通过I型光反应产生足够的超氧阴离子并且部分生成的超氧阴离子可通过超氧化物歧化酶(SOD)介导的歧化反应、以及Fenton反应转化为H2O2和剧毒的羟自由基(OH
·
)，以增强对癌细胞的损伤作用。此外，尼罗蓝具有水溶性、近红外发射、高荧光量子产率和低细胞毒性等优异性能，使其成为适合生物成像的荧光团。这些特性使ENBS成为肿瘤诊断和治疗的良好候选荧光团。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种用于CEs检测和肝癌治疗的近红外(NIR)荧光探针，可进一步反映活细胞内CEs的活性。
[0006]本专利技术提供的荧光探针优选的以2
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氯苯二甲基氨基甲酸酯作为CEs的水解位点和淬灭剂连接到ENBS上。在与CEs反应后，ENBS的释放通过三个自发的步骤进行。这种生物转化导致ENBS的荧光发射急剧增加。同时，该荧光探针可在激光照射下通过PDT产生对癌细胞具有高度毒性的活性氧(ROS)，达到综合诊疗的目的。本专利技术提供的荧光探针为肝癌的体外监测和治疗提供了一种新的工具。
[0007]本专利技术提供了一种用于检测羧酸酯酶的荧光探针，所述荧光探针的结构通式如式I所示：
[0008][0009]其中R1为羟基、卤素、烷基或烷氧基的单取代；R2为识别基团。
[0010]优选的，所述R2为甲酸酯、乙酸酯或氨基甲酸酯。
[0011]优选的，所述荧光探针的结构式如式II所示：
[0012][0013]本专利技术提供了所述荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
[0014]1)将硫酸铝水溶液与N,N
‑
二乙基
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对苯二胺混合，然后依次加入硫代硫酸钠和氯化锌，反应后冷却得到第一反应混合物，向所述第一反应混合物中添加重铬酸钾水溶液，冰浴，得到第二反应混合物，加热回流第二反应混合物得到式III所示化合物；
[0015][0016]2)将1
‑
萘胺、式III所示化合物与第一有机溶剂混合，进行第一回流获得第一回流液，将碳酸银与第一回流液混合，进行第二回流得到式IV所示化合物；
[0017][0018]3)在惰性气体保护下，将式IV化合物、N,N
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二异丙基乙胺和三光气在第二有机溶剂中搅拌1～3h，获得混合物溶液，所述混合物溶液在惰性气体保护下，80～90℃回流10～12h后，加入式V所示化合物搅拌10～12h，得到式II所示化合物；
[0019][0020]优选的，步骤2)中所述第一有机溶剂为醇类溶剂。
[0021]优选的，步骤3)中所述第二有机溶剂为无水二氯甲烷。
[0022]优选的，步骤2)中所述第一回流的温度为68～72℃，所述第一回流的时间为3～5h；所述第二回流的温度为68～72℃，所述第二回流的时间为3～5h。
[0023]本专利技术还提供了所述的荧光探针在制备羧酸酯酶检测试剂中的应用。
[0024]本专利技术还提供了所述的荧光探针在制备肝癌体外监测试剂中的应用。
[0025]本专利技术还提供了所述的荧光探针在制备肿瘤光动力治疗药物中的应用。
[0026]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术提供的荧光探针本身由于PET效应不发出荧光，当与羧酸酯酶反应后，氨基甲酸酯结构水解释放出羟基，进一步氯代苯环结构发生自消除，荧光团部分重新恢复荧光，从而实现对羧酸酯酶的特异性检测，为肝癌的体外监测和治疗提供了一种新的工具。
[0027]根据实施例的记载，本专利技术提供的荧光探针能够测定CEs且在高表达CEs的HepG
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2细胞中荧光强度更强，在与CEs抑制剂BNPP孵育后，荧光强度减弱，说明本专利技术提供的荧光探针可用于CEs的检测，在CEs相关的生理病理及相关疾病的研究有广阔的应用前景。
附图说明
[0028]图1为本专利技术提供的式II所示的荧光探针CEP1的合成路线图；
[0029]图2为羧酸酯酶CEs激活荧光探针CEP1的机制示意图；
[0030]图3为在有或没有羧酸酯酶CEs(1U/mL)存在的情况下，荧光探针CEP1(5μM)在PBS(pH 7.4)中的吸收(A)和荧光发射(B)光谱；
[0031]图4为荧光探针CEP1在黑暗或光照条件下对HepG
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2细胞和HL
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7702细胞的细胞毒性作用；
[0032]图5为荧光探针CEP1(10μM)在活细胞HL
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7702和HepG
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2细胞中于0.5h和1h时间点的荧光成像；BNPP组:用BNPP(100μM)预处理HepG
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2细胞30min，然后与荧光探针CEP1(10μM)孵育1h，λex＝633nm，λem＝670～780nm；比例尺:20μm。
具体实施方式
[0033]本专利技术提供了一种用于检测羧酸酯酶的荧光探针，所述荧光探针的结构通式如式I所示：
[0034][0035]其中R1为羟基、卤素、烷基或烷氧基的单取代；所述R1优选为氯；R2为识别基团。
[0036]在本专利技术中，所述R2优选为氨基甲酸酯，所述荧光探针的结构式优选的如式II所示：
[0037][0038]本专利技术提还供了式II所示荧本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测羧酸酯酶的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针的结构通式如式Ⅰ所示：其中R1为羟基、卤素、烷基或烷氧基的单取代；R2为识别基团。2.根据权利要求1所述的荧光探针，其特征在于，所述R2为甲酸酯、乙酸酯或氨基甲酸酯。3.根据权利要求2所述的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针的结构式如式IⅠ所示：4.权利要求3所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将硫酸铝水溶液与N,N
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二乙基
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对苯二胺混合，然后依次加入硫代硫酸钠和氯化锌，反应后冷却得到第一反应混合物，向所述第一反应混合物中添加重铬酸钾水溶液，冰浴，得到第二反应混合物，加热回流第二反应混合物得到式III所示化合物；2)将1
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萘胺、式Ⅲ所示化合物与第一有机溶剂混合，进行第一回流获得第一回流液，将碳酸银与第一回流液混合，进行第二回流得到式Ⅳ所示化合物；3)在惰性气体保护下，将式Ⅳ化合物、N...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨德志，汪蓓蕾，梁梦圆，
申请(专利权)人：遵义医科大学，
类型：发明
国别省市：