一种快速鉴定布鲁菌的方法及其使用的引物组组合技术

本发明专利技术公开了一种快速鉴定布鲁菌的方法及其使用的引物组组合。本发明专利技术通过对布鲁菌的核心基因组序列进行分析，从而获得了5个布鲁菌12个种间的高度保守特异序列(即布鲁菌的特异序列标签)，之后依据5个布鲁菌的特异序列标签的核苷酸序列设计并合成五个引物组。每个引物组可以完全覆盖布鲁菌现有的12个种的鉴定。目前，国内外尚无利用本发明专利技术提供的布鲁菌的特异序列标签特异性鉴定布鲁菌的荧光定量PCR方法，本发明专利技术提供的方法可以简单、快速、灵敏、特异的检测布鲁菌，避免漏检，为布病疫情的早期预警及其防控提供有力支撑。本发明专利技术具有重要的应用价值。应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种快速鉴定布鲁菌的方法及其使用的引物组组合


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种快速鉴定布鲁菌的方法及其使用的引物组组合。

技术介绍

[0002]布鲁菌病(Brucellosis，简称“布病”)是一种由布鲁菌引起的人畜共患传染病。布鲁菌为革兰阴性杆菌。根据不同的宿主偏好、表型、致病性以及病原学特征，布鲁菌一般可分为6个经典种19个生物型，分别为B.melitensis(羊)、B.abortus(牛)、B.suis(猪)、B.canis(犬)、B.neotomae(沙林鼠)和B.ovis(绵羊)；6个新发现的种，分别为B.microti(田鼠)、B.pinnipedialis(鳍足类)、B.ceti(鲸类)、B.inopinata(从人类天然宿主中分离出来)、B.papionis(狒狒)和B.vulpis(狐狸)。布鲁菌不同种、型之间亲缘性很近。早在1968年，国外学者就对公认的6种布鲁菌进行了测序鉴定，结果表明，布鲁菌各菌种之间高度同源，基因组一致性达90％以上，各菌种之间基因组差异较小。目前，已有多种检测布鲁菌的方法，如细菌培养分离法、血清学诊断法以及免疫学方法，但上述方法均存在诸多不足。
[0003]随着测序技术的快速发展，测序成本不断下降、测序速度和准确性不断提高，这使得布鲁菌群体基因组学的应用日益增多。尽管如此，由于布鲁菌与其他物种之间的高度相似性，使得检测工作存在诸多问题。因此，需要更可靠、更准确的靶标来帮助研究人员快速识别布鲁菌，并将其与相关物种区分开。
[0004]随着分子生物学技术的发展，荧光定量PCR检测技术已逐渐成为诊断布病的重要工具。但现阶段，研究者们针对布鲁菌所建立的荧光定量PCR方法存在特异性问题，如引物探针与其他菌属存在交叉。因此，筛选布鲁菌高特异序列，并针对筛选的序列设计一种高灵敏度、特异性的引物探针通过荧光定量PCR方法对布鲁菌进行鉴定，可以更好地加强布病病原监测能力，为布病的防治提供强有力的技术支撑。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是简单、快速、灵敏、特异性的检测布鲁菌，避免漏检。
[0006]本专利技术首先保护一种引物组组合，可包括引物组BRU
‑
1、引物组BRU
‑
2、引物组BRU
‑
3、引物组BRU
‑
4和/或引物组BRU
‑
5；
[0007]引物组BRU
‑
1可由引物对BRU
‑
1和探针BRU
‑1‑
P组成。引物对BRU
‑
1可由引物BRU
‑1‑
F和引物BRU
‑1‑
R组成。探针BRU
‑1‑
P的一个末端具有荧光标记，另一端具有荧光猝灭基团。引物BRU
‑1‑
F的核苷酸序列可如SEQ ID NO:1所示。引物BRU
‑1‑
R的核苷酸序列可如SEQ ID NO:2所示。探针BRU
‑1‑
P的核苷酸序列可如SEQ ID NO:3所示。
[0008]引物组BRU
‑
2可由引物对BRU
‑
2和探针BRU
‑2‑
P组成。引物对BRU
‑
2可由引物BRU
‑2‑
F和引物BRU
‑2‑
R组成。探针BRU
‑2‑
P的一个末端具有荧光标记，另一端具有荧光猝灭基团。引物BRU
‑2‑
F的核苷酸序列可如SEQ ID NO:4所示。引物BRU
‑2‑
R的核苷酸序列可如SEQ ID NO:5所示。探针BRU
‑2‑
P的核苷酸序列可如SEQ ID NO:6所示；
[0009]引物组BRU
‑
3可由引物对BRU
‑
3和探针BRU
‑3‑
P组成。引物对BRU
‑
3可由引物BRU
‑3‑
F和引物BRU
‑3‑
R组成。探针BRU
‑3‑
P的一个末端具有荧光标记，另一端具有荧光猝灭基团。引物BRU
‑3‑
F的核苷酸序列可如SEQ ID NO:7所示。引物BRU
‑3‑
R的核苷酸序列可如SEQ ID NO:8所示。探针BRU
‑3‑
P的核苷酸序列可如SEQ ID NO:9所示；
[0010]引物组BRU
‑
4可由引物对BRU
‑
4和探针BRU
‑4‑
P组成。引物对BRU
‑
4可由引物BRU
‑4‑
F和引物BRU
‑4‑
R组成。探针BRU
‑4‑
P的一个末端具有荧光标记，另一端具有荧光猝灭基团。引物BRU
‑4‑
F的核苷酸序列可如SEQ ID NO:10所示。引物BRU
‑4‑
R的核苷酸序列可如SEQ ID NO:11所示。探针BRU
‑4‑
P的核苷酸序列可如SEQ ID NO:12所示。
[0011]引物组BRU
‑
5可由引物对BRU
‑
5和探针BRU
‑5‑
P组成。引物对BRU
‑
5可由引物BRU
‑5‑
F和引物BRU
‑5‑
R组成。探针BRU
‑5‑
P的一个末端具有荧光标记，另一端具有荧光猝灭基团。引物BRU
‑5‑
F的核苷酸序列可如SEQ ID NO:13所示。引物BRU
‑5‑
R的核苷酸序列可如SEQ ID NO:14所示。探针BRU
‑5‑
P的核苷酸序列可如SEQ ID NO:15所示。
[0012]上述任一所述荧光标记具体可为FAM荧光基团。
[0013]上述任一所述荧光猝灭基团具体可为BHQ1荧光猝灭基团。
[0014]所述引物组组合具体可由所述引物组BRU
‑
1、所述引物组BRU
‑
2、所述引物组BRU
‑
3、所述引物组BRU
‑
4和/或所述引物组BRU
‑
5组成。
[0015]本专利技术还保护上述任一所述引物组组合的应用，可为b1)或b2)或b3)：
[0016]b1)鉴定布鲁菌；
[0017]b2)检测待测样品是否含有布鲁菌；
[0018]b3)制备用于鉴定布鲁菌的试剂盒；
[0019]所述应用用于非疾病的诊断与治疗。
[0020]本专利技术还保护DNA片段甲、DNA片段乙、DNA片段丙、DNA片段丁或DNA片段戊。
[0021]所述DNA片段甲的核苷酸序列可如SEQ ID NO:16所示或SEQ 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.引物组组合，包括引物组BRU
‑
1、引物组BRU
‑
2、引物组BRU
‑
3、引物组BRU
‑
4和/或引物组BRU
‑
5；引物组BRU
‑
1由引物对BRU
‑
1和探针BRU
‑1‑
P组成；引物对BRU
‑
1由引物BRU
‑1‑
F和引物BRU
‑1‑
R组成；探针BRU
‑1‑
P的一个末端具有荧光标记，另一端具有荧光猝灭基团；引物BRU
‑1‑
F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；引物BRU
‑1‑
R的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；探针BRU
‑1‑
P的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；引物组BRU
‑
2由引物对BRU
‑
2和探针BRU
‑2‑
P组成；引物对BRU
‑
2由引物BRU
‑2‑
F和引物BRU
‑2‑
R组成；探针BRU
‑2‑
P的一个末端具有荧光标记，另一端具有荧光猝灭基团；引物BRU
‑2‑
F的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；引物BRU
‑2‑
R的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；探针BRU
‑2‑
P的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；引物组BRU
‑
3由引物对BRU
‑
3和探针BRU
‑3‑
P组成；引物对BRU
‑
3由引物BRU
‑3‑
F和引物BRU
‑3‑
R组成；探针BRU
‑3‑
P的一个末端具有荧光标记，另一端具有荧光猝灭基团；引物BRU
‑3‑
F的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；引物BRU
‑3‑
R的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；探针BRU
‑3‑
P的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；引物组BRU
‑
4由引物对BRU
‑
4和探针BRU
‑4‑
P组成；引物对BRU
‑
4由引物BRU
‑4‑
F和引物BRU
‑4‑
R组成；探针BRU
‑4‑
P的一个末端具有荧光标记，另一端具有荧光猝灭基团；引物BRU
‑4‑
F的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；引物BRU
‑4‑
R的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示；探针BRU
‑4‑
P的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示；引物组BRU
‑
5由引物对BRU
‑
5和探针BRU
‑5‑
P组成；引物对BRU
‑
5由引物BRU
‑5‑
F和引物BRU
‑5‑
R组成；探针BRU
‑5‑
P的一个末端具有荧光标记，另一端具有荧光猝灭基团；引物BRU
‑5‑
F的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示；引物BRU
‑5‑
R的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示；探针BRU
‑5‑
P的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示。2.权利要求1所述引物组组合的应用，为b1)或b2)或b3)：b1)鉴定布鲁菌；b2)检测待测样品是否含有布鲁菌；b3)制备用于鉴定布鲁菌的试剂盒；所述应用用于非疾病的诊断与治疗。3.DNA片段甲、DNA片段乙、DNA片段丙、DNA片段丁或DNA片段戊；所述DNA片段甲的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示或SEQ ID NO:16自5
’
末端起第357至515位所示；所述DNA片段乙的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示或SEQ ID NO:17自5
’
末端起第593至779位所示；所述DNA片段丙的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示或SEQ ID NO:18自5
’
末端起第827至945位所示；所述DNA片段丁的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示或SEQ ID NO:19自5
’
末端起第631至783位所示；所述DNA片段戊的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示或SEQ ID NO:20自5
’
末端起第275至376位所示。4.权利要求3所述DNA片段甲、所述DNA片段乙、所述DNA片段丙、所述DNA片段丁或所述
DNA片段戊的应用，为b1)或b2)或b3)或b4)：b1)鉴定布鲁菌；b2)检测待测样品是否含有布鲁菌；b3)作为分子标记；b4)制备用于鉴定布鲁菌的试剂盒；所述应用用于非疾病的诊断与治疗。5.一种检测待测样品是否含有布鲁菌的方法，包括如下步骤：以待测样品的基因组DNA为模板，采...

【专利技术属性】
技术研发人员：辛文文，李佳欣，张嘉鑫，康琳，王景林，王菁，高姗，袁媛，徐健皓，李岩伟，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：