糖苷水解酶BvGH18在防治植物螨害中的应用制造技术

本发明专利技术属于农业微生物学技术领域，具体涉及糖苷水解酶BvGH18在防治植物螨害中的应用。通过基因工程手段将糖苷水解酶BvGH18的基因构建到冷休克载体pColdII上，并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，获得重组蛋白BvGH18，通过蛋白序列比对分析，糖苷水解酶BvGH18属于GH18糖苷水解酶家族。实验证明BvGH18蛋白具有一定的几丁质酶活性：0.299 U/mg，对二斑叶螨24 h半致死浓度为4.826

【技术实现步骤摘要】
糖苷水解酶BvGH18在防治植物螨害中的应用


[0001]本专利技术属于农业微生物学
，具体涉及糖苷水解酶BvGH18在防治植物螨害中的应用。

技术介绍

[0002]叶螨属(Tetranychus)隶属于蛛形纲，蜱螨亚纲，真螨目，叶螨科(Tetranychidae)。作为植食性螨类，叶螨的很多种类严重影响着粮食作物、经济作物和观赏植物，其中包括著名的二斑叶螨(Tetranychus urticae)、朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)、柑橘全爪螨(Panonychus citri)，严重危害我国果蔬、棉花以及茶叶等经济作物的产量和质量。叶螨体型微小，常在叶片的背面取食叶片，不易被察觉，在作物受害的初期由于未表现出明显的为害症状，因而其危害容易被忽视。加上叶螨繁殖速度快、适应性强、寄主广及易产生抗药性等特点，一旦爆发极易成灾。
[0003]目前，针对叶螨的防控与治理多采用传统的化学防治方法，随着化学杀螨剂的滥用，叶螨抗药性剧增，致使螨害愈加严重，不利于农业环境的绿色、可持续发展。目前市面上的杀螨剂大多数为难溶于水的化学物质或是抗生素，相较之下，小分子物质如蛋白类的报道较少。因此，利用新手段开发绿色、高效的叶螨生防制剂是本领域技术人员亟待解决的问题，具有非常重要的实践意义。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供糖苷水解酶BvGH18或含有糖苷水解酶BvGH18的发酵产物在防治植物螨害中的应用，所述的糖苷水解酶BvGH18为SEQ ID NO.2所示。r/>[0005]本专利技术的另一个目的是提供了糖苷水解酶BvGH18在制备叶螨杀螨剂中的应用。
[0006]本专利技术为了实现上述目的，采用以下技术方案：
[0007]糖苷水解酶BvGH18或含有糖苷水解酶BvGH18的发酵产物在防治植物螨害中的应用，所述的糖苷水解酶BvGH18为SEQ ID NO.2所示，或是加了的其余基因表达元件的SEQ ID NO.2蛋白，所述的元件包括：增强子，纯化标签等；
[0008]纯化标签包括：亲和纯化标签，荧光标签，硫氧还蛋白等融合蛋白标签。
[0009]所述的应用过程包括，以糖苷水解酶BvGH18为有效成分之一或者唯一有效成分用于植物螨害的杀灭，杀灭方式为触杀；
[0010]糖苷水解酶BvGH18或含有糖苷水解酶BvGH18的发酵产物在制备杀叶螨的制剂中的应用，包括以SEQ ID NO.2所示蛋白为有效成分之一，或者唯一有效成分，制备成的叶螨杀灭剂。
[0011]以上所述的应用中，优选的，所述的叶螨为二斑叶螨或朱砂叶螨、柑橘全爪螨。
[0012]与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：
[0013]本专利技术首次报道了18家族糖苷水解酶具备杀螨活性，为新型杀螨剂的制备提供了新的酶源。
[0014]包含糖苷水解酶BvGH18的杀螨剂具有高效、低毒、对环境友好的特点，在生物防治叶螨方面具有良好的应用前景。
附图说明
[0015]图1为糖苷水解酶BvGH18纯化后的SDS
‑
PAGE电泳分析图。
[0016]图2为糖苷水解酶BvGH18对二斑叶螨的作用效果图。
[0017]图3为糖苷水解酶BvGH18几丁质酶活性测定。
具体实施方式
[0018]下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为报道的微生物学常规操作方法。所述试剂或材料，如未特别说明均为本领域的常规方案。
[0019]本专利技术涉及到的BvGH18蛋白，可用本领域的常规方式，例如原核表达、商业合成等方式得到。本专利技术以原核表达BvGH18蛋白为例，对其抑螨活性进行说明，其他方式获得的该蛋白也能行使相同的功能。
[0020]实施例1：
[0021]杀螨BvGH18蛋白的获得
[0022](1)构建重组质粒：
[0023]按照SEQ ID NO.1所示序列(编码SEQ ID NO.2所示蛋白)，人工合成BvGH18蛋白基因片段bvgh18(北京擎科生物科技有限公司)，并连接至大肠杆菌冷休克蛋白表达载体pColdII上，得到重组表达质粒pColdII
‑
bvgh18。
[0024](2)杀螨BvGH18蛋白基因在大肠杆菌中的表达和纯化
[0025]将重组质粒pColdII
‑
bvgh18导入到大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组菌株BL21(DE3)/pColdII
‑
bvgh18。挑取重组菌单克隆，接种于50mL LB液体培养基中(含终浓度为100μg/mL氨苄青霉素)，37℃、200rpm/min振荡培养至OD
600
达到0.8，加入终浓度为1.0mmol/L的异丙基
‑
B
‑
D硫代半乳糖苷(即IPTG)于20℃诱导培养12h。将上述50mL重组菌BL21(DE3)/pColdII
‑
bvgh18的IPTG诱导培养物8,000rpm离心5min收集菌体，再用10mL 10mmol/L PBS缓冲液重悬菌体，冰上超声破碎菌体(超声功率300W，破碎10s，间歇10s，处理10min)，12,000rpm离心15min收集细菌裂解液上清，然后用0.22μm孔径的滤膜过滤除杂，利用His标签蛋白纯化柱纯化目标蛋白。
[0026]经由大肠杆菌表达的重组蛋白序列从N端至C端分别为翻译增强子、His标签以及目标蛋白BvGH18序列(SEQ ID NO.2所示蛋白序列，其理论分子量约为48.3kDa)，其理论蛋白质分子量约为49.7kDa。对纯化后的重组蛋白溶液进行SDS
‑
PAGE电泳检测，结果如图1所示，与预计的重组蛋白分子量大小基本吻合，证明本专利技术的BvGH18蛋白在大肠杆菌中成功表达。
[0027]实施例2：
[0028]1)BvGH18蛋白的杀叶螨活性：
[0029]参照FAO(联合国粮农组织)推荐的标准方法——叶螨玻片浸渍法。将双面胶带剪成2
‑
3cm长的方形，贴在载玻片的一端，揭去胶带上的纸片，用0号毛笔挑选大小一致、体色鲜艳、行动活泼的雌成螨，将其背部黏于双面胶上(注意：不要粘住螨足、螨须和口器)。在温
度25℃、相对湿度85％的生化培养箱中放置2
‑
3h后，用双目镜镜检，剔除死亡、受伤与不活泼个体。将待测药剂(实施例1中BvGH18蛋白过柱纯化前的细菌裂解液上清)在预试基础上用10mmol/L PBS缓冲液稀释5
‑
7个浓度梯度，再将带螨玻片的一端浸于药液中轻轻振荡5s后取出，迅速吸去螨体及其周围的多余药液，随后置于上述生化培养箱中，24h后用双目镜观察试验结果。用毛笔轻触螨体，以螨足不动者为死亡。每个处理重复3次，另以浸渍10mmol/L PBS缓冲液作为空白对照。生测实验显示，纯化前的BvGH18蛋白粗酶液显示出良好的杀螨活性。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.糖苷水解酶BvGH18或含有糖苷水解酶BvGH18的发酵产物在防治植物螨害中的应用，所述的糖苷水解酶BvGH18为SEQ ID NO.2所示，或是加了的基因表达元件的SEQ ID NO.2蛋白，所述的基因表达元件包括：增强子，纯化标签。2.根据权利要求1所述的应用，所述的纯化标签为：亲和纯化标签，荧光标签，硫氧还蛋白。3.根据权利要求1所述的应用，其应用过程是以糖苷水解酶BvGH18或含有糖苷水解酶BvGH18的发酵产物为有效成分之一或者唯...

【专利技术属性】
技术研发人员：邱一敏，杜思源，刘晓艳，闵勇，陈凌，朱镭，饶犇，田宇曦，陈伟，
申请(专利权)人：湖北省生物农药工程研究中心，
类型：发明
国别省市：