用于检测遗传性耳聋基因的引物探针组合、试剂盒及应用制造技术

本申请公开了一种用于检测遗传性耳聋基因的引物探针组合、试剂盒及应用，其中引物如SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.36所示，探针如SEQ ID NO.39~SEQ ID NO.61所示。试剂盒包括上述引物和探针、反应液，以及基于POCT需要的封闭隔离材料、裂解液、洗液A、洗液B和可熔性材料。本申请引物探针在巢式PCR的基础上，结合实时荧光PCR技术，可以高灵敏和高特异性的同时对多个基因的多个突变位点进行检测，同时试剂盒满足了微流控卡盒自动化的试剂需求，具有时效性、特异性、灵敏性、便捷性等多个方面的优点。便捷性等多个方面的优点。

【技术实现步骤摘要】
用于检测遗传性耳聋基因的引物探针组合、试剂盒及应用


[0001]本申请属于分子生物学检测领域，涉及一种用于检测遗传性耳聋基因的引物探针组合、试剂盒及应用。

技术介绍

[0002]耳聋是常见的致残性疾病之一，严重影响人们的沟通交流及生活质量，据研究统计，约60％的先天性耳聋为遗传性耳聋，这其中又有70％为非综合征性耳聋，在非综合征性耳聋中，可分为常染色体遗传、性连锁遗传和线粒体母系遗传。常染色体基因有两个等位基因，一个来自父方，一个来自母方，其中一个等位基因突变，称为单杂合突变，两个等位基因突变，称为复合杂合突变或纯合突变。与常染色基因线性结构不同，线粒体基因是环性结构，故线粒体基因突变表达方法也不同，常表示为均质突变或异质突变，前者可理解为纯合突变，后者可理解为单杂合突变。由于基因碱基缺失或替换的突变，构成病理性变异，导致基因功能异常，从而造成耳聋。
[0003]减少遗传性耳聋的发生重在早期预防及干预，其中，明确耳聋病因是预防及干预的关键。运用分子诊断技术检测耳聋基因突变位点，不仅可以为临床提供诊断依据还可以指导患者及高危人群优生优育，提高人口质量。随着基因诊断技术的进步，目前耳聋基因检测技术种类较多，针对不同人群采取针对性的检测技术，可以在分子水平明确耳聋病因，实现遗传性耳聋的精准诊断，为精准治疗及精准预防提供理论基础。
[0004]目前常用的检测技术包括：测序法、PCR
‑
SSCP法、实时荧光PCR法、基因芯片法和限制性片段质谱多态性技术等。由于遗传性耳聋基因诊断涉及多个基因的检测，目前常用的技术操作繁琐、通量低。具体的：
①
直接测序法：是将基因组核酸进行测序分析的方法。测序法可检测已知和可能的未知变异位点，是最常用的基因检测方法之一，一般作为基因检测的金标准。是目前公认的检测遗传性耳聋基因突变最准确的方法，但当进行多基因多样本分析时，则价格昂贵且耗时费力。
②
PCR
‑
SSCP分析技术：是一种基于单链DNA构象差别的快速、敏感、有效地检测基因点突变的DNA多态方法。其基本原理是对已知有基因点突变的遗传病，在其突变位点附近设计引物进行PCR扩增，将扩增的产物取出一部分(一般为1pl)，变性后在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳，由于单链DNA中碱基配对或聚集，当温度或变性剂等环境改变会引起不同的构象，此方法操作复杂且繁琐，不适用于临床检测。
③
实时荧光PCR法：该方法操作简便，具有较强的灵敏性，可检测变异发生率低于10％的基因变异，但是只能检测已知、单一位点的变异，对于少数变异位点监测不失为一种简便、快速且廉价的方法，难以胜任多位点变异的同时检测。
④
基因芯片法：这种办法目前用得比较多，而且比较成熟，优点是检查的位点比较多，另外就是一次性可检查的样本量比较大，但是产业化难。
⑤
限制性片段质谱多态性技术：该技术是将PCR
‑
RFLP技术与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术结合，灵敏度高，能够发现数量不足耳聋基因准种池1％的变异位点，但其同样仅能检测已知位点变异，且价格昂贵，很难在临床推广应用。
[0005]综上，现有针对遗传性耳聋基因的检测存在操作复杂、检测成本高、耗时长，无法
同时对多个突变位点进行检测等缺陷。因此，继续开发一种可同时多重检测遗传性耳聋基因的方法，具有重大意义。

技术实现思路

[0006]针对现有技术存在的缺陷，本申请旨在提供一种用于检测遗传性耳聋基因的引物和探针组合，其中引物组合在巢式PCR的基础上，结合实时荧光PCR技术，可以高灵敏和高特异性的同时对多个基因的多个突变位点进行检测。
[0007]另一方面，本申请基于实时荧光PCR即时检测(point
‑
of
‑
care testing，POCT)以及本申请的引物和探针体系，提供了一种用于检测遗传性耳聋基因的试剂盒，该试剂盒基于POCT技术，可以一次性检测多种遗传性耳聋基因，对临床用药具有指导意义。
[0008]作为本申请的一个实施方案，提供了一种用于检测遗传性耳聋基因的引物组合，所述引物包括检测GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因和12SrRNA基因的引物；
[0009]在巢式第一次PCR中，
[0010]检测所述GJB2基因的引物的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的下游引物；
[0011]检测所述GJB3基因的引物的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.3所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的下游引物；
[0012]检测所述SLC26A4基因的引物的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.5所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的下游引物，和如SEQ ID NO.7所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的下游引物；
[0013]检测所述12SrRNA基因的引物的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.9所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的下游引物；
[0014]在巢式第二次PCR中，
[0015]检测所述GJB2基因的引物的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.11所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的下游引物，和如SEQ ID NO.13所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示的下游引物，和如SEQ ID NO.15所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示的下游引物；
[0016]检测所述GJB3基因的引物的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.17所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示的下游引物；
[0017]检测所述12SrRNA基因的引物的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.19所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示的下游引物；
[0018]检测所述SLC26A4基因的引物的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.21所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示的下游引物，和如SEQ ID NO.23所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示的下游引物，和如SEQ ID NO.25所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示的下游引物，如SEQ ID NO.27所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示的下游引物，和如SEQ ID NO.29所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示的下游引物，和如SEQ ID NO.31所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示的下游引物，和如SEQ ID NO.33所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示的下游引物，和如SEQ ID NO.35所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示的下游本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测遗传性耳聋基因的引物探针组合，其特征在于，所述引物包括检测GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因和12SrRNA基因的引物：在巢式第一次PCR中，检测所述GJB2基因的引物的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的下游引物；检测所述GJB3基因的引物的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.3所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的下游引物；检测所述SLC26A4基因的引物的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.5所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的下游引物，和如SEQ ID NO.7所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的下游引物；检测所述12SrRNA基因的引物的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.9所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的下游引物；在巢式第二次PCR中，检测所述GJB2基因的引物的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.11所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的下游引物，和如SEQ ID NO.13所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示的下游引物，和如SEQ ID NO.15所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示的下游引物；检测所述GJB3基因的引物的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.17所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示的下游引物；检测所述12SrRNA基因的引物的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.19所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示的下游引物；检测所述SLC26A4基因的引物的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.21所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示的下游引物，和如SEQ ID NO.23所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示的下游引物，和如SEQ ID NO.25所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示的下游引物，如SEQ ID NO.27所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示的下游引物，和如SEQ ID NO.29所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示的下游引物，和如SEQ ID NO.31所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示的下游引物，和如SEQ ID NO.33所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示的下游引物，和如SEQ ID NO.35所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示的下游引物；所述特异性探针用于检测GJB2基因、GJB3基因、SLC26A4基因和12SrRNA基因的突变位点：检测GJB2基因突变位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.39～47所示的特异性探针；检测GJB3基因突变位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.48所示的特异性探针；检测12SrRNA基因突变位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.49～50所示的特异性探针；检测SLC26A4基因突变位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.51～61所示的特异性探针。2.根据权利要求1所述的一种用于检测遗传性耳聋基因的引物探针组合，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.39～SEQ ID NO.41所示的特异性探针的结合位置分别位于SEQ ID NO.11所示上游引物和下游引物SEQ ID NO.12之间；核苷酸序列如SEQ ID NO.42～SEQ ID NO.44所示的特异性探针的结合位置分别位于SEQ ID NO.13所示上游引物和下游
引物SEQ ID NO.14之间；核苷酸序列如SEQ ID NO.45～SEQ ID NO.47所示的特异性探针的结合位置分别位于SEQ ID NO.15所示上游引物和下游引物SEQ ID NO.16之间；核苷酸序列如SEQ ID NO.48所示的特异性探针的结合位置分别位于SEQ ID NO.17所示上游引物和下游引物SEQ ID NO.18之间。核苷酸序列如SEQ ID NO.49～SEQ ID NO.50所示的特异性探针的结合位置分别位于SEQ ID NO.19所示上游引物和下游引物SEQ ID NO.20之间；核苷酸序列如SEQ ID NO.51～SEQ ID NO.53所示的特异性探针的用以检测引物对SEQ ID NO.21～22和引物对SEQ ID NO.23～24扩增片段的突变位点；核苷酸序列如SEQ ID NO.54～SEQ ID NO.55所示的特异性探针的结合位置分别位于SEQ ID NO.25所示上游引物和下游引物SEQ ID NO.26之间；核苷酸序列如SEQ ID NO.56～SEQ ID NO.58所示的特异性探针的用以检测引物对SEQ ID NO.27～28和引物对SEQ ID NO.29～30扩增片段的突变位点；核苷酸序列如SEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵怀，华灿忠，徐文彪，刘蒙蒙，
申请(专利权)人：杭州遂真生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：