一种用于检测CRISPR-Cas蛋白切割活性的双荧光素酶报告细胞系及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测CRISPR

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测CRISPR
‑
Cas蛋白切割活性的双荧光素酶报告细胞系及其应用


[0001]本专利技术属于分子生物学
更具体地，涉及一种用于检测CRISPR
‑
Cas蛋白切割活性的双荧光素酶报告细胞系及其应用。

技术介绍

[0002]CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)是原核生物基因组内的一段重复序列。为了将病毒的外来入侵基因清除，细菌进化出了CRISPR
‑
Cas系统，以此抵抗病毒的浸染。CRISPR
‑
Cas系统存在于大多数细菌与所有的古菌中，自其被发现以来，CRISPR
‑
Cas系统在临床应用、基础研究或者分析检测方面都体现出了极大的前景。
[0003]为了更好地利用CRISPR
‑
Cas系统，优化CRISPR
‑
Cas系统，提高Cas蛋白的活性和递送是当前的研究热点。另由于CRISPR
‑
Cas蛋白的额外活性，在对靶位点编辑的同时会对其他基因位点进行编辑，造成脱靶。因此，开发CRISPR
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Cas蛋白的调节剂用于控制CRISPR
‑
Cas蛋白的活性，以提高该系统的安全性也是需要关注的方向。
[0004]深度测序虽然可以比较精确的显示CRISPR
‑
Cas蛋白的编辑效率，但是该方法的操作复杂。绿色荧光蛋白(GFP)报告系统被广泛应用于蛋白定位追踪和高通量药物筛选，具有检测方便、价钱便宜等优点。目前，基于荧光蛋白的报告系统也被应用于评估CRISPR系统的活性；当GFP基因被编辑以后，GFP蛋白表达下降，荧光信号减弱，从而可以评价CRISPR系统的活性。但是GFP在细胞里面的半衰期较长，检测到显著的GFP荧光猝灭至少需要2天，没有办法快速响应基因位点双链断裂的情况。同时，由于CRISPR
‑
Cas蛋白对靶位点的切割比较快，例如，SpCas9在1天左右就基本对靶位点完成了切割，至少50％的靶向切割发生在6小时内，而基于荧光蛋白的报告细胞难以快速、高效评估CRISPR
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Cas蛋白的切割活性。因此，为了评估CRISPR
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Cas系统在细胞里面的切割活性，需要建立灵敏、快速精确的高通量检测方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术要解决的技术问题是克服现有上述技术的缺陷和不足，提供一种用于检测CRISPR
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Cas蛋白切割活性的双荧光素酶报告细胞系及其应用。
[0006]本专利技术的第一个目的是提供一种用于检测CRISPR
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Cas蛋白切割活性的双荧光素酶报告细胞系的制备方法。
[0007]本专利技术的第二个目的是提供用于检测CRISPR
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Cas蛋白切割活性的双荧光素酶报告细胞系。
[0008]本专利技术的第三个目的是提供所述细胞系在检测CRISPR
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Cas蛋白切割活性、评估CRISPR
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Cas蛋白在细胞内切割动力、筛选CRISPR
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Cas蛋白突变体或筛选CRISPR
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Cas蛋白调控剂中的应用。
[0009]本专利技术的第四个目的是提供所述细胞系在制备检测CRISPR
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Cas蛋白切割活性、评估CRISPR
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Cas蛋白在细胞内切割动力、筛选CRISPR
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Cas蛋白突变体或筛选CRISPR
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Cas蛋白调控剂的产品中的应用。
[0010]本专利技术的第五个目的是提供一种检测CRISPR
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Cas蛋白切割活性的方法。
[0011]本专利技术的第六个目的是提供雷公藤红素、二氢丹参酮I、10
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羟基喜树碱、盐酸拓扑替康中的任意一种或几种在抑制SpCas9活性或制备抑制SpCas9的抑制剂中的应用。
[0012]本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：
[0013]本专利技术提供了一种用于检测CRISPR
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Cas蛋白切割活性的双荧光素酶报告细胞系的制备方法，包括以下步骤：
[0014]S1.在所用报告细胞的管家基因的终止密码子前插入绿色荧光蛋白与分泌型纳米荧光素酶的融合表达基因，筛选成功定点插入融合表达基因的单克隆细胞；
[0015]S2.利用带筛选标记的慢病毒载体将萤火虫荧光素酶基因随机插入步骤S1所得单克隆细胞的基因组，筛选含萤火虫荧光素酶活性的单克隆细胞，培养得用于检测CRISPR
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Cas蛋白切割活性的双荧光素酶报告细胞系。
[0016]具体地，步骤S1所述报告细胞为HEK293细胞。
[0017]具体地，步骤S1所述管家基因为ACTG1。
[0018]具体地，步骤S1所述绿色荧光蛋白为增强型的绿色荧光蛋白，所述纳米荧光素酶的N端含有分泌信号肽，绿色荧光蛋白和纳米荧光素酶之间含有可以剪切的linker。
[0019]作为可选择的实施方式，步骤S1所述绿色荧光蛋白与分泌型纳米荧光素酶的融合表达基因为eGFP
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P2A
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Nluc，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
[0020]具体地，步骤S2利用带嘌呤霉素N
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乙酰转移酶基因的慢病毒载体将萤火虫荧光素酶基因随机插入步骤S1所得单克隆细胞的基因组，用嘌呤霉素筛选含萤火虫荧光素酶活性的单克隆细胞。
[0021]利用上述制备方法，本专利技术获得了一种可快速、高效、灵敏地检测CRISPR
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Cas蛋白切割活性的细胞系。具体地，本专利技术以HEK293细胞作为报告细胞，将绿色荧光蛋白与分泌型纳米荧光素酶的融合表达基因(eGFP
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P2A
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Nluc)敲入到管家基因ACTG1的3
’
端的终止密码子TGA的前面，筛选成功定点插入融合表达基因的单克隆细胞，命名为HEK293
‑
ACTG1
‑
KI
‑
Nluc
‑
#2；同时用带嘌呤霉素N
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乙酰转移酶基因的慢病毒载体将萤火虫荧光素酶基因随机插入所得单克隆细胞HEK293
‑
ACTG1
‑
KI
‑
Nluc
‑
#2的基因组，用嘌呤霉素筛选萤火虫荧光素酶活性高的单克隆细胞，命名为HEK293
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ACTG1
‑
KI
‑
Nluc
‑
#2
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Fluc
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#2，培养得用于检测CRISPR
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Cas蛋白切割活性的双荧光素酶报告细胞系。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测CRISPR
‑
Cas蛋白切割活性的双荧光素酶报告细胞系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.在所用报告细胞的管家基因的终止密码子前插入绿色荧光蛋白与分泌型纳米荧光素酶的融合表达基因，筛选成功定点插入融合表达基因的单克隆细胞；S2.利用带筛选标记的慢病毒载体将萤火虫荧光素酶基因随机插入步骤S1所得单克隆细胞的基因组，筛选含萤火虫荧光素酶活性的单克隆细胞，培养得到用于检测CRISPR
‑
Cas蛋白切割活性的双荧光素酶报告细胞系。2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S1所述报告细胞为HEK293细胞，所述管家基因为ACTG1。3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S1所述绿色荧光蛋白为增强型的绿色荧光蛋白，所述纳米荧光素酶的N端含有分泌信号肽，绿色荧光蛋白和纳米荧光素酶之间含有可以剪切的linker。4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤S2利用带嘌呤霉素N
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乙酰转移酶基因的慢病毒载体将萤火虫荧光素酶基因随机插入步骤S1所得单克隆细胞的基因组，用嘌呤霉素筛选含萤火虫荧光素酶活性的单克隆细胞。5.权利要求1～4任一所述制备方法制备所得用于检测CRISPR
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Cas蛋白切割活性的双荧光素酶报告细胞系。6.权利要求5所述细胞系在检测CRISPR
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Cas蛋白切割活性、评估CRISPR
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Cas蛋白在细胞内切割动力、筛选CRISPR
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Cas蛋白突变体或筛选CRISPR
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Cas蛋白调控剂中的应用。7.权利要求5所述细胞系在制备检测CRISPR
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【专利技术属性】
技术研发人员：松阳洲，杨悦，何梓彬，马文宾，梁普平，陈昱僖，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：