基因启动子区甲基化水平检测试剂在制备ccRCC预后试剂中的应用及试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及涉及基因启动子区甲基化水平检测试剂在制备ccRCC预后试剂中的应用。在一个具体实施方案中，所述基因启动子区甲基化水平检测试剂为检测以下位点的甲基化水平的检测试剂：cg13965612、cg00869668、cg03933495、cg23067082、cg06303238、cg21655830、cg03021802、cg06941557、cg25598840、cg01286935、cg23462514、cg17367832、cg06577005、cg18210365、cg17868751、cg14947429、cg24332577、cg26728517。本发明专利技术通过构建出一个优于当前所有预后方法的针对ccRCC的预后模型，医生可根据该预后模型指示的风险评分为患者提供最适的治疗手段。的风险评分为患者提供最适的治疗手段。的风险评分为患者提供最适的治疗手段。

【技术实现步骤摘要】
基因启动子区甲基化水平检测试剂在制备ccRCC预后试剂中的应用及试剂盒


[0001]本专利技术涉及ccRCC的诊断与预后领域，更特别的，涉及基因启动子区甲基化水平检测试剂在制备ccRCC预后试剂中的应用。

技术介绍

[0002]肾透明细胞癌(ccRCC)是一种常见的肾细胞癌，占据了肾细胞癌的 80％
‑
90％，具有较高的复发率、转移率及死亡率。ccRCC是一种高度异质的肿瘤，具有从缓慢生长的局部肿瘤到向远处转移的侵袭性肿瘤等复杂多变的临床表现。
[0003]目前，ccRCC的预后分析方法包括TNM分级、UISS评分、SSIGN评分以及Leibovich评分，然而这些分级和评分在很大程度上依赖于病理学家的经验与主观判断。
[0004]ccRCC术后患者的预后判断仍主要基于TNM分期。欧洲泌尿外科协会 (EAU)指南指出，术后预测系统、诺模图(Nomogram)可能较常规的TNM 分期、Fuhrman分级对预后的预测更加准确。既往有一些ccRCC预后相关的 Nomogram研究，但多数只纳入传统的临床信息，如肿瘤分期、分级等变量，并且仅关注模型的准确性，较少关注临床获益，从而无法全面评估模型的临床应用价值。
[0005]Nomogram作为一种可视化的、具有临床应用价值的医学预测模型，可以提供更加准确且个性化的预后评估。Nomogram可以客观评估新的预测变量。研究认为临床症状与ccRCC患者预后有关，此结论在既往研究中存在争议，这可能是因为病情较轻的患者往往无明显的临床症状。<br/>[0006]既往有研究建立Nomogram来评估RCC患者预后，其中Karakiewicz PI 等的Nomogram较为经典且广为引用。研究用于评估RCC患者术后的肿瘤特异性生存，其研究纳入2474例患者，经单因素和多因素Cox回归分析后，最终的Nomogram包括了肿瘤分期、Fuhrman分级、肿瘤大小和临床症状，预测准确性为89％。但该研究纳入变量较少，只分析传统的肿瘤学特征，并未纳人其他可能与预后有关的变量。Yaycioglu O等研究非转移性RCC患者的无复发生存情况，发现年龄、性别、存在放射性淋巴结、临床症状、肿瘤大小和临床分期是预后相关预测因子，其最终构建的Nomogram的CI为0.747。
[0007]随着分子生物学技术的发展，越来越多的分子标记被用于疾病的诊断和预后。但是，对于ccRCC而言，还缺少了足够的差异甲基化位点，未能构建出有效的预后模型。因此，需要找到更多与ccRCC预后有关的分子标记，用来构建更可靠的ccRCC的预后模型。

技术实现思路

[0008]我们在研究中开发由18个差异甲基化位点构成的风险评分模型，并找出了高风险与低风险患者之间的风险评分切值，运用该风险评分模型和切值，可对ccRCC患者的治疗和进展前景进行有效而准确的预测，优于当前所有关于ccRCC的预后方法。
[0009]基于以上工作，本专利技术提供了基因启动子区甲基化水平检测试剂在制备 ccRCC预
后试剂中的应用。
[0010]在一个具体实施方案中，所述基因启动子区甲基化水平检测试剂为检测以下位点的甲基化水平的检测试剂：cg13965612、cg00869668、cg03933495、 cg23067082、cg06303238、cg21655830、cg06941557、cg25598840、 cg01286935、cg23462514、cg17367832、cg06577005、cg18210365、cg17868751、cg14947429、cg24332577、cg26728517。
[0011]本专利技术还提供了一种ccRCC预后试剂，包括基因启动子区甲基化水平检测试剂。
[0012]在一个具体实施方案中，所述基因启动子区甲基化水平检测试剂为检测以下位点的甲基化水平的检测试剂：cg13965612、cg00869668、cg03933495、 cg23067082、cg06303238、cg21655830、cg06941557、cg25598840、 cg01286935、cg23462514、cg17367832、cg06577005、cg18210365、 cg17868751、cg14947429、cg24332577、cg26728517。
附图说明
[0013]图1训练集的风险评分，其中，A为患者的风险评分排列和生存状态，B 为高风险群体和低风险群体的KM生存曲线，C为风险评分的1年、3年、5 年和10年ROC曲线。
[0014]图2测试集的风险评分，其中，A为患者的风险评分排列和生存状态，B 为高风险群体和低风险群体的KM生存曲线，C为风险评分的1年、3年、5 年和10年ROC曲线。
[0015]图3为TCGA数据库中所有ccRCC患者的风险评分，其中，A为患者的风险评分排列和生存状态，B为高风险群体和低风险群体的KM生存曲线，C为风险评分的1年、3年、5年和10年ROC曲线。
[0016]图4为基于预后模型和临床症状的诺模图，其中，A为预后模型和临床症状的单变量回归分析，B为预后模型和临床症状的单变量回归分析，C为预测ccRCC患者存活1年、3年、5年和10年可能性的诺模图。
[0017]图5为模型校准和ROC评价，其中，A为高风险群体和低风险群体的KM 生存曲线，B为预测ccRCC患者1年、3年、5年和10年OS的诺模图，C
‑
F 为风险评分(黑线)、肿瘤分级诊断(蓝线)、年龄(黄线)、肿瘤组织学分级(绿线)和诺莫评分(红线)在1年(C)、3年(D)、5年(E)和10 年(F)的ROC曲线。
具体实施方式
[0018]以下对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。
[0019]1.差异甲基化位点的发现
[0020]招募10个ccRCC患者，获取肿瘤样本，进行基因组DNA提取。使用内切酶MspI酶切基因组DNA，并进行末端修复，然后将酶切产物跑胶分离，选择大小为40
‑
120bp和120
‑
220bp的片段，采用ZYMO EZ DNAMethylation
‑
Goldkit进行Bisulfite处理并进行PCR扩增，构建文库，将合格的文库进行甲基化测序，获得的甲基化测序数据。
[0021]2.模型构建
[0022]我们将甲基化测序数据与参考基因组和Lambda DNA比对，计算位点甲基化水平，通过聚类分析和差异甲基化位点分析。得到2261个差异甲基化区域(DMR)，位于启动子区。
从2261个DMR中筛选出578个DMR，这578 个DMR对应408个450K微阵列上的位点。
[0023]从TCGA
‑
KIRC数据库获取478例患者的数据，其中319例样本数据作为训练集，159例作为测试集，进行单变量Cox回归分析，研本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基因启动子区甲基化水平检测试剂在制备ccRCC预后试剂中的应用。2.根据权利要求1所示的应用，其特征在于，所述基因启动子区甲基化水平检测试剂为检测以下位点的甲基化水平的检测试剂：cg13965612、cg00869668、cg03933495、cg23067082、cg06303238、cg21655830、cg06941557、cg25598840、cg01286935、cg23462514、cg17367832、cg06577005、cg18210365、cg17868751、cg14947429、cg24332577、cg26728517。3.一种ccRCC...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓琼，杜野，王铸，王杰艳，陈业达，张建文，张颖，梁辉，
申请(专利权)人：深圳市龙华区人民医院，
类型：发明
国别省市：