一种鳗鲡疱疹病毒RPA引物及检测试剂盒制造技术

本发明专利技术为一种鳗鲡疱疹病毒RPA引物及检测试剂盒，属于生物检测技术领域。该鳗鲡疱疹病毒RPA引物，包括上游引物和下游引物；所述上游引物为SEQID NO:1～SEQ ID NO:8所示的引物的任意一种；所述下游引物为SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:11所示的引物的任意一种。通过本发明专利技术中的鳗鲡疱疹病毒RPA引物设计得到的检测试剂盒，具有较高的检测灵敏度，且大大缩短了检测时间。时间。时间。

【技术实现步骤摘要】
一种鳗鲡疱疹病毒RPA引物及检测试剂盒


[0001]本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种鳗鲡疱疹病毒RPA引物及检测试剂盒。

技术介绍

[0002]鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus，AngHV)是线性双链DNA病毒，基因组全长248kb，含136个开放阅读框(ORF)，属于疱疹病毒目(Herpesvirales)鱼蛙疱疹病毒科(Alloherpesviridae)鲤疱疹病毒属(Cyprinivirus)。鳗鲡疱疹病毒是鳗鲡养殖过程中常见病害之一，其诊断和防治难度均高于细菌、寄生虫等病原引起的疾病，常对鳗鲡产业造成巨大经济损失。
[0003]目前，已建立了几种检测鳗鲡疱疹病毒的方法，包括免疫过氧化物酶单层实验(IPMA)、原位杂交、PCR及免疫间接荧光抗体实验(IFAT)等，但这些方法均存在操作复杂、费时的缺点，普通PCR通常需要花费3个小时。申请公告号为CN110894550A的中国专利技术专利公开了一种鳗鲡疱疹病毒的RAA恒温荧光检测方法和检测试剂盒，包括一条特异性荧光探针，但该方法价格昂贵，需要精密昂贵的专门仪器，不适用于现场检测和基层科研单位。
[0004]重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification，RPA)技术是一种等温核酸扩增技术，目前已应用于医学病原物的快速诊断、转基因作物检测、植物病害的病原检测。RPA于2006年由英国TwistDx Inc公司成功开发。虽然RPA恒温扩增法创立较晚，但其发展速度较快。与其他恒温扩增技术相比，RPA的主要优点如下：(1)可在23～45℃条件下进行扩增反应，最适温度为37～42℃，在常温下即可完成扩增过程，不需要热变性；(2)可在20～40min内获得目的扩增产物，核酸扩增速度较快；(3)不需要十分精密昂贵的温控设备，更适用于基层科研和现场检测；(4)RPA因其使用相对简单，与其他恒温扩增方法相比具有更高的敏感性、特异性。
[0005]因此，研发一种应用于鳗鲡疱疹病毒的RPA引物及检测试剂盒，不仅能提升鳗鲡疱疹病毒的检测确诊率，还能普及基层科研单位的检测能力，也对早期预警鳗鲡疱疹病毒的扩散蔓延具有重要意义。

技术实现思路

[0006]为了克服上述现有技术的缺陷，本专利技术所要解决的技术问题是：提供一种检测准确性高，可普及基层科研单位的鳗鲡疱疹病毒RPA引物及检测试剂盒。
[0007]为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：一种鳗鲡疱疹病毒RPA引物，包括上游引物和下游引物；
[0008]所述上游引物为SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:8所示的引物的任意一种；
[0009]所述下游引物为SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:11所示的引物的任意一种(见表1)。
[0010]表1
[0011][0012][0013]本专利技术采用的另一技术方案为：一种鳗鲡疱疹病毒检测试剂盒，包括鳗鲡疱疹病毒RPA引物和阳性标准品。
[0014]本专利技术的有益效果在于：本专利技术的鳗鲡疱疹病毒RPA引物灵敏度高，检测效果稳定，而且与鳗鲡圆环病毒(Eel circovirus)、鳗鲡双RNA病毒(Eel virus European)和罗非
鱼湖病毒(Tilapia lake virus)无交叉反应，表现出良好的特异性。基于本专利技术中的鳗鲡疱疹病毒RPA设计得到检测试剂盒，具有较高的检测灵敏度，至少能够检测至10
‑3μg/mL，比同等条件下鳗鲡疱疹病毒PCR检测灵敏度高10倍，检测时间仅需要20～40min，大大缩短了检测时间，可用于基层科研单位及发病现场的病毒检测。
附图说明
[0015]图1为本专利技术实施例三中部分鳗鲡疱疹病毒RPA引物组合的凝胶电泳图；
[0016]图2为本专利技术实施例三中部分鳗鲡疱疹病毒RPA引物组合的凝胶电泳图；
[0017]图3为本专利技术具体实施方式中的鳗鲡疱疹病毒RPA引物的特异性检测凝胶电泳图；
[0018]图4为本专利技术具体实施方式中鳗鲡疱疹病毒的RPA引物的重复性检测凝胶电泳图；
[0019]图5为本专利技术具体实施方式中鳗鲡疱疹病毒的RPA引物的不同反应时间凝胶电泳图；
[0020]图6为本专利技术具体实施方式中鳗鲡疱疹病毒的RPA引物的灵敏度检测凝胶电泳图；
[0021]图7为本专利技术具体实施方式中普通PCR反应体系的灵敏度检测凝胶电泳图。
具体实施方式
[0022]为详细说明本专利技术的
技术实现思路
、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
[0023]本专利技术最关键的构思在于：通过设计鳗鲡疱疹病毒RPA引物及检测试剂盒，提高检测灵敏度，缩短检测时间。
[0024]请参照图1至图3所示，本专利技术的一种鳗鲡疱疹病毒RPA引物，包括上游引物和下游引物；
[0025]上游引物为SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:8所示的引物的任意一种；
[0026]下游引物为SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:11所示的引物的任意一种。
[0027]从上述描述可知，本专利技术的有益效果在于：本申请的鳗鲡疱疹病毒RPA引物是基于保守序列设计得到，扩增片段大小为200～400bp左右，在设计上，需满足：(1)从病毒保守序列单链选择30～36个碱基作为上游或下游引物；(2)扩增产物片段一般不超过500bp；(3)控制GC含量在20～70％之间；(4)单核苷酸重复的最大允许长度为5。这样设计可以能够避免错配，保证有效快速扩增并确保扩增稳定进行。
[0028]本专利技术的鳗鲡疱疹病毒RPA引物灵敏度高，检测效果稳定，而且与鳗鲡圆环病毒(Eel circovirus)、鳗鲡双RNA病毒(Eel virus European)和罗非鱼湖病毒(Tilapia lake virus)无交叉反应，表现出良好的特异性。
[0029]进一步地，上游引物为SEQ ID NO:7所示的引物,下游引物为SEQ ID NO:10所示的引物；
[0030]或上游引物为SEQ ID NO:1所示的引物,下游引物为SEQ ID NO:9所示的引物；
[0031]或上游引物为SEQ ID NO:2所示的引物,下游引物为SEQ ID NO:9所示的引物；
[0032]或上游引物为SEQ ID NO:5所示的引物,下游引物为SEQ ID NO:9所示的引物；
[0033]或上游引物为SEQ ID NO:6所示的引物,下游引物为SEQ ID NO:9所示的引物。
[0034]从上述描述可知，以上组合的鳗鲡疱疹病毒RPA引物特异性表现较好。
[0035]进一步地，上游引物为SEQ ID NO:4所示的引物,下游引物为SEQ ID NO:9所示的引物。
[0036]从上述描述可知，组合为SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:9的鳗鲡疱疹病毒RPA引物特异性表现最佳。
[0037]本本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鳗鲡疱疹病毒RPA引物，其特征在于，包括上游引物和下游引物；所述上游引物为SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:8所示的引物的任意一种；所述下游引物为SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:11所示的引物的任意一种。2.根据权利要求1所述的鳗鲡疱疹病毒RPA引物，其特征在于，所述上游引物为SEQ ID NO:7所示的引物,所述下游引物为SEQ ID NO:10所示的引物；或上游引物为SEQ ID NO:1所示的引物,所述下游引物为SEQ ID NO:9所示的引物；或上游引物为SEQ ID NO:2所示的引物,所述下游引物为SEQ ID NO:9所示的引物；或上游引物为SEQ ID NO:5所示的引物,所述下游引物为SEQ ID NO:9所示的引物；或上游引物为SEQ ID NO:6所示的引物,所述下游引物为SEQ ID NO:9所示的引物。3.根据权利要求1所述的鳗鲡疱疹病毒RPA引物，其特征在于，所述上游引物为SEQ ID NO:4所示的引物,所述下游引物为SEQ ID NO:9所示的引物。4.一种鳗鲡疱疹病毒检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～3任一项所述的鳗鲡疱疹病毒RPA引物和阳性标准品。5.根据权利要求4所述的鳗鲡疱疹病毒检测试剂盒，...

【专利技术属性】
技术研发人员：林而舒，卓玉琛，陈斌，林煜，钟全福，樊海平，曾占壮，
申请(专利权)人：福建省淡水水产研究所，
类型：发明
国别省市：