致病性MDV的meq与pp38双基因缺失株构建方法及应用技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种致病性MDV的meq与pp38双基因缺失株构建方法及应用，本发明专利技术基于MDV超强毒株Md5的BAC感染性克隆，利用Red两步同源重组的方法，成功构建meq和pp38双基因缺失的MDV毒株，命名为MZ

【技术实现步骤摘要】
致病性MDV的meq与pp38双基因缺失株构建方法及应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及致病性MDV的meq与pp38双基因缺失株构建方法及应用，即使在致病性MDV毒株基因组基础上构建meq与pp38双基因缺失株的方法及应用。

技术介绍

[0002]近年来，随着马立克氏病病毒(Marek
’
s disease virus，MDV)毒力的不断进化，病毒有不断突破现有疫苗的免疫保护的趋势，因此需要研发新一代高效疫苗来应对病毒的挑战。现有的研究利用粘粒技术构建了MDV meq基因缺失株Md5BAC
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meq，meq缺失毒株完全失去致瘤性的同时，能够抵抗MDV强毒株和特强毒株的攻击，提供了优于CVI988/Rispens的免疫保护效果。但meq基因缺失毒株仍然引起鸡体免疫抑制，因此，很难将其商品化。通过对Md5BAC
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meq在CEF上进行传代致弱，能够消除其对鸡体的免疫抑制，但降低了免疫保护效果。
[0003]MDV的pp38基因位于基因组的长独特区和长内部重复区，该基因编码一个38kDa的磷酸化蛋白，因此命名为pp38。研究发现其在病毒溶细胞感染阶段高表达，重要的是，Md5BAC
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pp38在鸡体内的早期复制能力降低，表明pp38可能参与淋巴细胞的早期溶细胞感染。现有的研究通过对病毒早期溶细胞感染的研究发现pp38基因的缺失对于B细胞的溶细胞感染和维持相关。病毒复制的早期溶细胞期直接与病毒引起宿主的免疫抑制相关。
[0004]上述这些研究无法证明pp38与meq基因同时缺失的相互作用关系，更缺乏pp38与meq基因双缺失的重组株的构建方法。

技术实现思路

[0005]为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种致病性重组MDV双基因缺失株的构建方法。
[0006]本专利技术的目的是提供一种致病性MDV的meq与pp38双基因缺失株构建方法，敲除Md5BAC株基因组中meq和pp38基因，pp38基因序列如SEQ ID No.9所示，meq基因序列如SEQ ID No.10所示。该毒株被命名为MZ
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1株，该株病毒对SPF鸡无免疫抑制等致病性，同时对MDV超强毒株具有很好的免疫保护效果。
[0007]meq基因序列，SEQ ID NO.9
[0008]ATGTCTCAGGAGCCAGAGCCGGGCGCTATGCCCTACAGTCCCGCTGACGATCCGTCCCCCCTCGATCTTTCTCTCGGGTCGACTTCGAGACGGAAAAAAAGGAAAAGTCACGACATCCCCAACAGCCCCTCCAAACACCCCTTCCCTGACGGCCTATCTGAGGAGGAGAAACAGAAGCTGGAAAGGAGGAGAAAAAGGAATCGTGACGCCGCTCGGAGAAGACGCAGGAAGCAGACGGACTATGTAGACAAACTCCATGAAGCATGTGAAGAGCTGCAGAGGGCCAATGAACACCTACGTAAGGAAATTCGAGATCTAAGGACTGAGTGCACGTCCCTGCGTGTACAGTTGGCTTGTCATGAGCCAGTTTGCCCTATGGCGGTACCCCTAACGGTGACCCTTGGACTGCTTACCACCCCGCACGATCCCGTTCCTGAACCTCCCATTTGCACTCCTCCACCTCCCTCACCGGATGAACCTAACGCTCCACATTGCTCCGGTTCCCAACCTCCTATCTGTACCCCCCCTCCT
CCCGATACGGAGGAACTTTGCGCCCAGCTCTGCTCGACCCCACCACCTCCCATCTCTACTCCCCATATTATCTACGCTCCGGGGCCTTCCCCCCTCCAACCTCCTATCTGTACCCCCGCTCCTCCCGATGCGGAGGAGCTTTGCGCCCAGCTCTGCTCGACCCCACCACCTCCCATCTGTACTCCCCATTCCCTCTTCTGCCCTCCCCAGCCTCCATCTCCGGAGGGCATCTTCCCTGCATTGTGTCCTGTTACCGAGCCGTGTACCCCTCCATCGCCGGGGACGGTTTACGCTCAGCTTTGTCCTGTTGGCCAGGTTCCCCTTTTTACCCCATCTCCCCCACATCCGGCTCCGGAGCCGGAGAGGCTTTATGCTCGTCTTACCGAGGATCCCGAACAGGATTCCTTGTATTCGGGCCAGATTTATACTCAGTTTCCCTCGGATACTCAGTCTACGGTCTGGTGGTTTCCAGGTGACGGGAGACCCTGA
[0009]pp38基因序列,SEQ ID NO.10
[0010]ATGGAATTCGAAGCAGAACACGAAGGGCTGACGGCGTCTTGGGTCGCCCCCGCTCCCCAGGGTGGAAAAGGGGCGGAGGGCCGCGCAGGGGTCGCCGACGAGGCAGGGCATGGGAAAACAGAAGCGGAATGCGCCGAGGACGGCGAGAAATGCGGGGACGCCGAGATGAGCGCTTTGGATCGGGTCCAGAGGGACCGGTGGAGATTCAGTTCTCCGCCCCCTCACTCTGGAGTCACGGGGAAGGGGGCTATTCCAATAAAGGGTGATGGGAAGGCGATAGAATGCCAGGAGCTAACCGGAGAGGGAGAGTGGCTGTCACAGTGGGAGGAGCTACCGCCTGAGCCCCGGAGGTCAGGGAATGAACATCTTGACGAAAGTCGGTATGCGAAACAAACCGAAAGGGGTAGCTCTACGGGGAAAGAAGAGGGAGATGGTATGAAGCAGATGGGGGAGCTTGCCCAGCAGTGCGAAGGAGGAACATATGCGGACTTGCTTGTCGAAGCAGAGCAAGCTGTTGTACATTCCGTTCGCGCATTAATGCTGGCCGAAAGACAAAACCCAAATATATTGGGGGAGCATTTGAATAAAAAACGGGTTCTTGTACAACGACCCCGTACTATTCTATCCGTGGAGTCAGAGAATGCAACAATGCGTTCTTATATGCTGGTTACATTGATCTGTTCTGCAAAATCATTATTACTAGGATCGTGCATGTCATTTTTCGCTGGTATGTTAGTCGGTAGAACGGCAGACGTAAAAACACCATTATGGGATACTGTATGTTTGTTAATGGCTTTCTGTGCAGGCATTGTCGTTGGGGGAGTGGATTCTGGGGAGGTGGAATCTGGAGAAACAAAATCTGAATCAAATTAA
[0011]优选的，上述致病性MDV的m本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.致病性MDV的meq与pp38双基因缺失株构建方法，其特征在于，敲除Md5BAC株基因组中meq和pp38基因，pp38基因序列如SEQ ID No.9所示，meq基因序列如SEQ ID No.10所示。2.根据权利要求1所述的致病性MDV的meq与pp38双基因缺失株构建方法，其特征在于，meq是MDV致肿瘤性基因和pp38是MDV早期复制相关基因，敲除方法具体包括：(1)用卡那基因取代MDV Md5BAC毒株中的meq基因，并筛选不具有Kana抗性的细菌克隆，得到含Md5BAC
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meq质粒的细菌克隆；(2)以含Md5BAC
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meq质粒的细菌克隆为出发菌株，参考上述(1)步骤，敲除pp38基因，得到致病性MDV的meq与pp38双基因缺失株。3.根据权利要求2所述的致病性MDV的meq与pp38双基因缺失株构建方法，其特征在于，用卡那基因取代MDV Md5BAC毒株中的meq基因的具体方法如下：构建Md5的BAC感染性克隆Md5BAC质粒，并转化入感受态细胞；合成引物SEQ ID No.1、SEQ ID No.2，并以含有Kana基因的质粒为模板，PCR扩增得到含有meq基因两端同源臂的Kana基因片段；将含有meq基因两端同源臂的Kana基因片段电转化进含有Md5BAC质粒的感受态细胞，复苏，筛选出氯霉素、卡那霉素双抗的阳性菌落，阳性菌落经阿拉伯糖处理，...

【专利技术属性】
技术研发人员：庄国庆，孙爱军，杜永坤，张改平，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：