一种全分子IgG抗体及其制备方法和应用技术

一种全分子IgG抗体及其制备方法和应用，所述抗体轻链抗原互补区CDR的氨基酸序列分别为SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7所示；抗体重链抗原互补区CDR的氨基酸序列分为SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.9，SEQ ID NO.10所示。本发明专利技术所制备的抗体，可有效与EVA71相结合，显示了良好的结合特性，可以用于识别并阻断EVA71感染。EVA71感染。EVA71感染。

【技术实现步骤摘要】
一种全分子IgG抗体及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属生物制药领域，涉及一种人鼠嵌合抗肠道病毒(Enterovirus，EV)A71衣壳的全分子IgG抗体，还涉及上述全分子IgG抗体的DNA分子、表达载体、宿主细胞和应用。

技术介绍

[0002]单克隆抗体技术已在疾病的诊断和治疗等发挥巨大的作用，极大提高了医疗技术水平，但常规的鼠或其它动物来源抗体因涉及动物使用一直受动物伦理争议，同时因其来源可引起很强的异种免疫反应，在人体应用受到很大限制。尽管国内已不少基于小鼠单克隆抗体的抗EVA71的开发和应用，但尚没有基因工程化及人鼠嵌合抗体的进一步应用。EVA71为肠道病毒71型是引起婴幼儿手足口病(hand
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foot and mouth disease；HFMD)主要病原体之一。在我国家仍有很高感染率，呈现区域性流行的趋势。因此，临床检测及可用的被动保护抗体也是十分必要。
[0003]人鼠嵌合工程化抗体技术也已日渐成熟，已是改变抗体分子本身免疫原性和功能特征的重要方法，同时保持抗体特定的识别特异性。目前已公布的以EVA71相关抗体多以小鼠为主，可用于临床检测开发等。本专利技术所制备的抗体，可有效与EVA71相结合，显示了良好的结合特性，且尚无相关功能的人鼠嵌合工程化抗体的文献报道。

技术实现思路

[0004]解决的技术问题：本专利技术旨在提供一种人鼠嵌合抗EVA71衣壳蛋白全分子IgG抗体及其制备方法和应用，该抗体能够识别并阻断EVA71感染。
[0005]技术方案：一种人鼠嵌合抗EVA71衣壳蛋白全分子IgG，所述抗体轻链抗原互补区CDR的氨基酸序列分别为SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7所示；抗体重链抗原互补区CDR的氨基酸序列分为SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.9，SEQ ID NO.10所示。
[0006]一种人鼠嵌合抗EVA71衣壳蛋白全分子IgG，所述抗体轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示，抗体重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示。
[0007]一种人鼠嵌合抗EVA71衣壳蛋白全VP1分子IgG，抗体轻链可变区的核酸序列为SEQ ID NO.1所示，抗体重链可变区的核酸序列为SEQ ID NO.2所示。
[0008]一种人鼠嵌合抗EVA71衣壳蛋白全分子IgG，抗体的轻链氨基酸序列为SEQ ID NO.11所示，重链氨基酸序列为SEQ ID NO.12所示。
[0009]含有上述核酸序列的质粒。
[0010]含有所述质粒的真核细胞。
[0011]上述人鼠嵌合抗EVA71衣壳蛋白全分子IgG在制备检测EV71试剂盒中的应用。
[0012]上述人鼠嵌合抗EVA71衣壳蛋白全分子IgG在制备阻断EV71感染诊断或治疗药物中的应用。
[0013]一种检测试剂盒，含有上述人鼠嵌合抗EVA71衣壳蛋白全分子IgG。
[0014]一种阻断EV71感染药物，含有上述人鼠嵌合抗EVA71衣壳蛋白全分子IgG。
[0015]有益效果：本专利技术所制备的抗体，可有效与EVA71相结合，显示了良好的结合特性，可以用于识别并阻断EVA71感染。
附图说明
[0016]图1为SDS
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PAGE检测图，M：Protein Marker 1：纯化浓缩抗体；
[0017]图2为酶联免疫吸附实验示意图；
[0018]稀释度1248163264OD值2.8451.9781.1620.5070.3220.1720.114
[0019]纯化抗体经20000倍稀释后再进行2倍连续稀释，CUTOFF值为0.015，最终检测滴度大于1:1280000；
[0020]图3为标准抗原检测示意图，
[0021]抗原浓度12562.531.2515.6257.81OD1.7841.1010.4810.2540.114
[0022]图4为Western Blot检测示意图；M：Protein Marker 1：VP1表达293T细胞2：VP1表达细胞上清3：对照293T细胞4：对照细胞上清；
[0023]图5为免疫荧光检测(293T转染)示意图，纯化的人源化抗体进行VP1转染后293T细胞免疫荧光检测，工作浓度为1g/mL，采用荧光显微镜进行拍照成像。图像分别为TRITC荧光通道，DAPI核染色通道及融合图片。
具体实施方式
[0024]1.鼠源抗EV A71衣壳蛋白VP1杂交瘤细胞的培养和准备；
[0025]2.鼠源抗EV A71抗体序列的扩增、测序、分析和鉴定；
[0026]3.人鼠嵌合抗EV A71全分子IgG的制备、表达及纯化；
[0027]4.人鼠嵌合抗EV A71全分子抗体的特性分析；
[0028]5.抗EV A71全分子IgG应用于检测。
[0029]实施例1.鼠源抗EV A71衣壳蛋白VP1杂交瘤细胞的培养和准备
[0030]跟据EV A71的基因序列，合成VP1相应序列并克隆入原核表达载体，原核表达纯化相应的抗原。
[0031]以表达的重组蛋白作为免疫原在纯系BALB/c小鼠腹部皮下注射进行免疫接种，每次200μg，共五次，在最后一次免疫接种为细胞融合前前七天进行腹腔内加强免疫。融合当天取小鼠脾脏，用DMEM培养基(美国GIBCO公司)制备成单细胞悬液，在50％PEG(PH 8.0)存在下，将脾细胞和SP2/0小鼠骨髓瘤细胞进行融合，用HAT选择性培养基(DMEM培养基98mL，HT贮存液1mL，A贮存液1mL)培养7天，换用HT培养基(DMEM培养基99mL，HT 1mL)培养。
[0032]实施例2.鼠源抗HEV抗体的筛选、制备和鉴定
[0033]根据杂交瘤细胞生长情况行酶联免疫法(ELISA)检测筛选，具体方法见下述。取检测阳性孔的细胞再次克隆化培养，经过3次亚克隆后，待所有的孔内单克隆细胞上清检测都为抗EVA71阳性，取数孔扩大培养并部分冻存。
[0034]ELISA方法筛选抗EVA71阳性，具体方法如下：
[0035](1)纯化原核表达的抗原，包被ELISA的96孔板，用包被液(0.1M碳酸盐缓冲液，
pH9.6)稀释至2μg/mL，每孔加入100μL，4℃过夜；
[0036](2)用PBST洗涤液(PBS含0.05％吐温)洗涤5次后加入5％BSA(200μL/孔)封闭，室温孵育2h，弃去封闭液后4℃保存；
[0037](3)每个孔中加入100μL杂交瘤细胞培养上清，以免疫小鼠的血清为阳性对照(1：1000稀释)，以空白组小鼠的血清为阴性对照(1:1000稀释)37℃孵育1h，弃动检测液体，用PBST洗涤液洗涤5次；
[0038](4)将以1:5000稀释的羊抗鼠Ig
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HRP第二抗体(Thermo公司)100μL/孔加入到孔内，3本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人鼠嵌合抗EVA71衣壳蛋白全分子IgG抗体，其特征在于，所述抗体轻链抗原互补区CDR的氨基酸序列分别为SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7所示；抗体重链抗原互补区CDR的氨基酸序列分为SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.9，SEQ ID NO.10所示。2.一种人鼠嵌合抗EVA71衣壳蛋白全分子IgG抗体，其特征在于，所述抗体轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示，抗体重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示。3.一种人鼠嵌合抗EVA71衣壳蛋白全VP1分子IgG抗体，其特征在于，抗体轻链可变区的核酸序列为SEQ ID NO.1所示，抗体重链可变区的核酸序列为SEQ ID NO.2所...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨永林，李倩，韩晶晶，陈宇，肖丽，
申请(专利权)人：泰州市人民医院，
类型：发明
国别省市：