一种糖基转移酶及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种糖基转移酶及其应用。糖基转移酶与SEQ ID NO:2相比包含选自以下一个或多个的残基位置处的氨基酸残基差异：第14位氨基酸为I；第189位氨基酸为L；第257位氨基酸为A、C、L、M、S或V；第265位氨基酸为E或A；第273位氨基酸为G；第302位氨基酸为G；第324位氨基酸为G；第347位氨基酸为G；第451位氨基酸为E；第455位氨基酸为D或C；并具有不低于如SEQ ID NO:2的氨基酸序列所示的糖基转移酶酶活性。本发明专利技术的糖基转移酶的酶活高、稳定性好；将其用于制备甜菊糖苷时与糖基转移酶亲本相比，在催化活性方面有了明显的提高，转化率显著提升。本发明专利技术解决了糖基供体UDPG、ADPG价格昂贵的问题，也提供底物多种选择可能性。也提供底物多种选择可能性。

【技术实现步骤摘要】
一种糖基转移酶及其应用


[0001]本专利技术涉及一种糖基转移酶及其在甜菊糖苷的糖基化反应中的应用。

技术介绍

[0002]甜菊糖苷(Steviol glycosides，又称甜菊醇糖苷)是从菊科草本植物甜叶菊叶中提取的天然甜味剂，是多种糖苷的混和物，不同甜菊糖苷在味质上存在较大的差异。甜菊糖苷具有纯天然(来自纯天然植物甜叶菊)、高甜度(蔗糖的250～450倍)、低热量(仅为白糖的1/300)、使用经济(成本仅为蔗糖的三分之一)、稳定性好(耐热、耐酸、耐碱，不易出现分解现象)、安全性高(无毒副作用)等优点，以及抗高血糖、抗高血压、抗炎症、抗肿瘤、抗腹泻等潜在疗效。
[0003]甜菊糖苷(甜菊糖苷类化合物)的结构式如下：
[0004][0005]序号化合物R1R21甜菊醇HH2甜菊醇单糖苷Hβ
‑
Glc3甜菊醇双糖苷Hβ
‑
Glc
‑
β
‑
Glc(2
‑
1)4甜茶苷β
‑
Glcβ
‑
Glc5甜菊苷(STV)β
‑
Glcβ
‑
Glc
‑
β
‑
Glc(2
‑
1)6莱鲍迪苷A(RA)β
‑
Glcβ
‑
Glc
‑
β
‑
Glc(2
‑
1)
‑
β
‑
Glc(3
‑
>1)7莱鲍迪苷B(RB)Hβ
‑
Glc
‑
β
‑
Glc(2
‑
1)
‑
β
‑
Glc(3
‑
1)8莱鲍迪苷C(RC)β
‑
Glcβ
‑
Glc
‑
α
‑
Rha(2
‑
1)
‑
β
‑
Glc(3
‑
1)9莱鲍迪苷D(RD)β
‑
Glc
‑
β
‑
Glc(2
‑
1)β
‑
Glc
‑
β
‑
Glc(2
‑
1)
‑
β
‑
Glc(3
‑
1)10莱鲍迪苷E(RE)β
‑
Glc
‑
β
‑
Glc(2
‑
1)β
‑
Glc
‑
β
‑
Glc(2
‑
1)11莱鲍迪苷F(RF)β
‑
Glcβ
‑
Glc
‑
α
‑
Xly(2
‑
1)
‑
β
‑
Glc(3
‑
1)12莱鲍迪苷M(RM)β
‑
Glc
‑
β
‑
Glc(2
‑
1)
‑
β
‑
Glc(3
‑
1)β
‑
Glc
‑
β
‑
Glc(2
‑
1)
‑
β
‑
Glc(3
‑
1)13杜可尔苷Aβ
‑
Glcβ
‑
Glc
‑
α
‑
Rha(2
‑
1)
[0006]上述甜菊糖苷类化合物，具有共同的糖苷配基：甜菊醇(Steviol)，区别在于C
‑
13和C
‑
19位置连接的糖基的数量和类型，主要包括甜菊苷(Stevioside)、莱鲍迪苷A(Rebaudioside A，Reb A)、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷D(Rebaudioside D，Reb D)、莱鲍迪苷E、杜克苷、甜菊双糖苷等八种糖苷。甜菊的叶子能够累积多达10
‑
20％(基于干重)甜菊糖苷。甜菊叶子中发现的主要糖苷是莱鲍迪苷A(2
‑
10％)、甜菊苷(2
‑
10％)和莱鲍迪苷C(1
‑
2％)。其他糖苷，如莱鲍迪苷B、D、E和F，甜菊双糖苷和甜茶苷，以低得多的水平被发现(大约0
‑
0.2％)。
[0007]虽然甜菊糖苷是一种高倍甜味剂，但存在后苦涩味这一缺点，严重限制了其在食品、饮料等对口感要求较高的领域中的应用。而引起甜菊糖苷后苦涩味的本质原因是其内在分子结构引起的，甜菊糖苷中的R1和R2基团上连接糖基数量越多口感越好。通常，发现甜菊苷比蔗糖甜110
‑
270倍，莱鲍迪苷A为150至320倍，然而，即使在高度纯化的状态下，甜菊糖苷仍然具有不合需要的味道属性，如苦味、甜的余味、甘草味等。
[0008]莱鲍迪苷D是其中最有应用潜力的甜菊糖苷，与其它甜菊糖苷相比，其甜度高，约为蔗糖的300
‑
350倍，且甜味纯正，口感也更接近蔗糖，没有苦味和甘草异味，稳定性好，是一种理想的天然高倍甜味剂产品。甜叶菊叶子中莱鲍迪苷D的含量极少(少于5％)，采用提取法生产莱鲍迪苷D需要大量的甜叶菊原料，另外富集莱鲍迪苷D的工艺繁琐，提取后需要多次过柱和脱盐、脱色、重结晶，并在生产过程中产生大量的废水，其生产成本较高，不适合工业化大生产。
[0009]目前生物酶法合成莱鲍迪苷D的方法需要外加昂贵的UDP
‑
葡萄糖为底物之一，通过UDP
‑
葡萄糖基转移酶(UDP
‑
glucosyltransferase，简称UGT)的作用，并且以甜菊苷或莱鲍迪苷A为底物，催化生成莱鲍迪苷D。但由于UDP
‑
葡萄糖极高的售价，几乎完全限制了工业化制备莱鲍迪苷D的可行性，经济性较差、缺乏市场竞争力。
[0010]莱鲍迪苷M(Rebaudioside M，RebM)具有更好的口感特性，但其占叶子干重的含量小于0.1％，导致分离成本高、价格昂贵。生物催化法获得高浓度的莱鲍迪苷M已引起了学者的关注。目前报道，来源甜叶菊的重组酶能催化莱鲍迪苷D生成莱鲍迪苷M，但产量较低。以莱鲍迪苷D为底物，通过微生物产酶催化法可获得莱鲍迪苷M，该方法较传统的提取法，不仅改善了生产流程，并且降低了对环境的污染，提高了目的产物莱鲍迪苷M的产率。但目前以生物酶催化法主要存在以下几个问题：(1)以生物酶催化莱鲍迪苷D生产莱鲍迪苷M的成本较高，并且酶催化产率有待进一步优化；(2)用于催化的糖基转移酶不易与产物分离并回收利用，且易失活；(3)天然植物中莱鲍迪苷A含量很高，而莱鲍迪苷D含量非常低，以低成本由莱鲍迪苷A直本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种糖基转移酶，其特征在于，所述糖基转移酶与SEQ ID NO:2相比包含选自以下一个或多个的残基位置处的氨基酸残基差异：第14位氨基酸为I；第189位氨基酸为L；第257位氨基酸为A、C、L、M、S或V；第265位氨基酸为E或A；第273位氨基酸为G；第302位氨基酸为G；第324位氨基酸为G；第347位氨基酸为G；第451位氨基酸为E；第455位氨基酸为D或C；并具有不低于如SEQ ID NO:2的氨基酸序列所示的糖基转移酶活性。2.如权利要求1所述的糖基转移酶，其特征在于，所述糖基转移酶与SEQ ID NO:2相比的氨基酸残基差异选自以下组：(1)第265位氨基酸为E；或，第257位氨基酸为A，第451位氨基酸为E；或，第265位氨基酸为E，第451位氨基酸为E；(2)第14位氨基酸为I，第257位氨基酸为A且第451位氨基酸为E；或第257位氨基酸为A、第451位氨基酸为E且第189位氨基酸为L；或，第257位氨基酸为A、第451位氨基酸为E且第273位氨基酸为G；或，第257位氨基酸为A、第451位氨基酸为E且第302位氨基酸为G；或第257位氨基酸为C、第451位氨基酸为E；或第257位氨基酸为L、第451位氨基酸为E；或第257位氨基酸为M、第451位氨基酸为E；或第257位氨基酸为S、第451位氨基酸为E；或第257位氨基酸为V、第451位氨基酸为E；或第257位氨基酸为A、第451位氨基酸为E且第265位氨基酸为A；(3)第257位氨基酸为A、第451位氨基酸为E、第189位氨基酸为L且第14位氨基酸为I；或，第257位氨基酸为A、第451位氨基酸为E、第189位氨基酸为L且第273位氨基酸为G；或，第257位氨基酸为A、第451位氨基酸为E、第189位氨基酸为L且第324位氨基酸为G；或，第257位氨基酸为A、第451位氨基酸为E、第189位氨基酸为L且第347位氨基酸为G；或，第257位氨基酸为A、第451位氨基酸为E、第189位氨基酸为L且第455位氨基酸为D或C。3.一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸编码如权利要求1或2所述的糖基转移酶。4.一种重组表达载体，其包含如权利要求3所述的核酸。5.一种转化体，其为包含如权利要求3...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴燕，田振华，郑孝富，王舒，
申请(专利权)人：弈柯莱生物科技上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：