一种肺炎球菌结合疫苗制备方法技术

本发明专利技术提供了一种糖缀合物，和将细菌荚膜多糖的羧基通过间隔物衍生后，再与载体蛋白结合制备糖缀合物的具体制备方法及一种包含所述糖缀合物的免疫原性组合物。本发明专利技术还公开了所述糖缀合物、免疫原性组合物在制备预防和/或治疗个体肺炎链球菌感染、与肺炎链球菌相关的疾病的药物或疫苗中的应用。本发明专利技术所述的糖缀合物具有免疫原性更高、杀菌作用更强的特点。点。点。

【技术实现步骤摘要】
一种肺炎球菌结合疫苗制备方法


[0001]本专利技术涉及疫苗研制
，具体涉及一种血清型肺炎链球菌荚膜多糖与载体蛋白反应制备获得的糖缀合物，一种包含所述糖缀合物的免疫原性组合物，以及所述的糖缀合物、免疫原性组合物在制备预防和/或治疗个体肺炎链球菌感染、与肺炎链球菌相关的疾病的药物或疫苗中的应用。

技术介绍

[0002]肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)为革兰氏阳性菌，细胞壁外的荚膜多糖有较厚的荚膜，肺炎球菌是引发儿童及老人罹患肺炎、菌血症、脑膜炎等的主要病原菌，在世界各地均有较高的发病率和死亡率。细菌的病原性和血清型常与荚膜多糖成分与结构有关，目前发现的肺炎链球菌荚膜多糖超过90种不同的血清型，其中，20多种已用于制备由肺炎链球菌感染所导致疾病的疫苗。肺炎链球菌缀合物疫苗是用于预防肺炎链球菌所致疾病的肺炎球菌疫苗，目前在全球上可以获得辉瑞公司的十三价疫苗Prevenar 13。
[0003]本专利技术人按照肺炎球菌在中国流行的清型的情况，开发了一款24价肺炎球菌结合疫苗，包含血清型为1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F。
[0004]其中，多种血清型在研究过程中利用传统的高碘酸钠法或CDAP(1
‑
氰基
‑4‑
(二甲氨基)吡啶四氟硼酸盐)法均可得到免疫原性较高的结合物。但12F等血清型多糖利用高碘酸钠法或CDAP法所得活化多糖的稳定性较差，而且最终结合物免疫应答较弱。
[0005]专利104870463A(CN201380066823)公开了一种12F血清型荚膜多糖制备结合物的新方法，由辉瑞公司开发。具体的，通过使用稳定的硝酰基相关的试剂/氧化剂作为氧化物质来制备包含与载体蛋白缀合的糖的糖缀合物的方法、包含此类糖缀合物的免疫原性组合物以及使用此类糖缀合物和免疫原性组合物的方法。该方法利用TEMPO
‑
NCS选择性氧化伯羟基产生醛基，制备活化多糖。
[0006]专利CN101247827公开了一种使用碳二亚胺缩合化学法进行糖
‑
蛋白缀合反应的改进方法：伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)的Vi糖结构上的羧基利用ADH衍生后与载体蛋白结合。肺炎球菌疫苗尚无利用糖环羧基偶联载体蛋白的产品上市。

技术实现思路

[0007]根据上述方法的技术缺陷或技术壁垒，本专利技术提供了多种制备12F型肺炎球菌荚膜多糖与蛋白缀合物的方法，利用糖环特异活化位点反应，获取12F型肺炎球菌荚膜多糖与蛋白载体偶联的糖缀合物，并且公开了12F型肺炎球菌荚膜多糖的活化位点，所述的活化位点为：乙酰氨基吡喃型甘露糖基羧基(β
‑
D
‑
ManpNAcA)。
[0008]本专利技术提供的糖缀合物的制备方法，经专利技术人深入研究，该方法适用于任何包含羧基的多糖，如血清型1、2、3、5、8、9N、9V、12F、22F等。本方法具有优于高碘酸钠或CDAP等活化方法的明显优点，所得的几种血清型的糖缀合物稳定性较高。
[0009]本专利技术所述的缀合物与现有技术中用高碘酸盐活化、CDAP活化或TEMPO
‑
NCS活化后与载体蛋白所得结合物相比，稳定性高，免疫原性高，杀菌作用显著改善。
[0010]具体地，本专利技术的第一方面，提供了一种糖缀合物，所述的糖缀合物为将细菌荚膜多糖的羧基通过间隔物衍生后，再与载体蛋白结合获得。
[0011]优选的，所述的细菌荚膜多糖选自肺炎链球菌1、2、3、5、8、9N、9V、12F或22F型荚膜多糖，所述的细菌荚膜多糖反应位点包括β
‑
D
‑
ManpNAcA、α
‑
D
‑
GalpA、D
‑
GlcpA、β
‑
D
‑
GlcpA、α
‑
D
‑
GlcpA或α
‑
D
‑
GlupA。
[0012]优选的，所述的细菌荚膜多糖为肺炎链球菌12F型荚膜多糖。
[0013]优选的，肺炎链球菌12F型荚膜多糖反应位点包括β
‑
D
‑
ManpNAcA。
[0014]优选的，所述的肺炎链球菌12F型荚膜多糖可以为天然的或人工合成的。
[0015]优选的，所述的间隔物包含通式Y1‑
L
‑
Y2，其中Y1包含可以与多糖中的羰基(或羧基)反应的第一伯胺基；Y2包含可以与连接体中的一个酯基反应的伯胺基；并且L是其他连接体中的连接部分。一般的L基团是具有1
‑
10个碳原子的直链烷基(例如C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C
10
)，特别地
‑
(CH2)4‑
。通式Y
‑
L
‑
Y的同型双功能连接体是特别合适作为间隔物的，其中两个Y基团是相同的，并且均能与羰基(或羧基)以及酯基反应；并且其中L是间隔物中的连接部分。一般Y基团是
‑
NHNH2基团。L通常具有通式
‑
L'
‑
L2‑
L'
‑
，其中L'是羰基。一般L2基团是具有1
‑
10个碳原子的直链烷基(例如C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C
10
)，特别地
‑
(CH2)4‑
。
[0016]优选的，所述的间隔物选自ADH(己二酸二酰肼)或CDH(羧二肼)。
[0017]在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的间隔物为ADH。
[0018]优选的，所述的活化的荚膜多糖与ADH的质量比为1：(1～30)(例如，1：1、1：2、1：3、1：4、1：5、1：6、1：7、1：8、1：9、1：10、1：11、1：12、1：13、1：14、1：15、1：16、1：17、1：18、1：19、1：20、1：21、1：22、1：23、1：24、1：25、1：26、1：27、1：28、1：29、1：30)。
[0019]优选的，所述的载体蛋白含有一个或多个氨基或羧基。所述的载体蛋白可以是来自靶标病原体的增强对该病原体的特异性免疫应答的相关蛋白抗原，或是主要作为佐剂或一般免疫应答刺激剂的一般免疫原性蛋白。
[0020]进一步优选的，所述的载体蛋白选自白喉类毒素突变体(CRM197/CRM)、破伤风类毒素(TT)、得自革兰氏阴性菌的外膜蛋白质、流感嗜血杆菌表面脂蛋白、由流感嗜血杆菌HiD蛋白基因和流感嗜血杆菌Hin47蛋白基因以1：1方式形成的融合蛋白、百日咳毒素、乙型肝炎表面抗原、乙型肝炎核心抗原、轮状病毒VP7蛋白质或呼吸道合胞病毒F和G蛋白或其活性部分。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种糖缀合物，其特征在于，所述的糖缀合物为将细菌荚膜多糖的羧基通过间隔物衍生后，再与载体蛋白结合获得，其中，所述的细菌荚膜多糖包括肺炎链球菌1、2、3、5、8、9N、9V、12F或22F型荚膜多糖，所述的荚膜多糖的反应位点包括β
‑
D
‑
ManpNAcA、α
‑
D
‑
GalpA、D
‑
GlcpA、α
‑
D
‑
GlcpA、β
‑
D
‑
GlcpA或α
‑
D
‑
GlupA。2.根据权利要求1所述的糖缀合物，其特征在于，所述的间隔物选自ADH或CDH。3.根据权利要求1所述的糖缀合物，其特征在于，所述的载体蛋白选自白喉类毒素突变体、破伤风类毒素、得自革兰氏阴性菌的外膜蛋白质、流感嗜血杆菌表面脂蛋白、由流感嗜血杆菌HiD蛋白基因和流感嗜血杆菌Hin47蛋白基因形成的融合蛋白、百日咳毒素、乙型肝炎表面抗原、乙型肝炎核心抗原、轮状病毒VP7蛋白质或呼吸道合胞病毒F和G蛋白或其活性部分。4.根据权利要求1所述的糖缀合物，其特征在于，所述的细菌荚膜多糖与载体蛋白的质量比为(0.3～3)：1。5.根据权利要求1
‑
4任一所述的糖缀合物，其特征在于，所述的细菌荚膜多糖的每10至30个糖重复单元，在所述载体蛋白与所述细菌荚膜多糖之间存在至少一个共价键。6.一种糖缀合物的制备方法，其特征在于，包括：将细菌荚膜多糖加入酸溶液水解，优选的，所述的酸溶液为醋酸溶液，得到细菌荚膜水解多糖，将细菌荚膜水解多糖与间隔物反应得到细菌荚膜多糖衍生物，将细菌荚膜多糖衍生物与载体蛋白结合制备糖缀合物；其中，所述的细菌荚膜多糖包括肺炎链球菌1、2、3、5、8、9N、9V、12F或22F型荚膜多糖，优选的，将细菌荚膜水解多糖与间隔物在EDAC存在下反应得...

【专利技术属性】
技术研发人员：王浩猛，刘磊，严志红，张慢慢，李军强，巢守柏，朱涛，
申请(专利权)人：康希诺生物股份公司，
类型：发明
国别省市：