一种接近天然分子的多肽融合分子制造技术

本发明专利技术旨在涉及生物医学或生物制药技术的领域中，创造一种接近天然状态的多结构域融合蛋白分子。本发明专利技术的融合蛋白由无免疫效应的抗体单链分子和特异性结合pMHC表位的多肽配体分子或其组成部分、或其片段，不需要或仅需要较短的肽段偶联形成。这些接近天然状态的蛋白结构域混合后可以形成具有生物学功能的融合蛋白分子，可以避免引入人工柔性肽链将各结构域连接成单一多肽链分子而可能存在免疫源性的风险。性的风险。

【技术实现步骤摘要】
一种接近天然分子的多肽融合分子


[0001]本专利技术涉及生物医学或生物制药
，更具体地涉及一种接近天然分子的多肽融合分子。

技术介绍

[0002]蛋白分子在细胞和机体中发挥各种生理功能。其中包括抗体，T细胞受体，酶和各种细胞因子等。目前大多数生物药大分子均由抗体分子通过各种蛋白工程手段演变而来。当组合多个蛋白结构域在一起时，最常用的方法就是利用一个蛋白结构域的C端通过柔性肽接上另一结构域的N端。比如scFv就是在抗体的重链或轻链的C端接上一条较长的15
‑
30个氨基酸的柔性肽，并且这柔性肽的C端可以通过肽键连接该抗体对应的轻链或重链的N端，以形成所谓的单链抗体。这柔性肽的最大的作用就是使重链和相应的轻链表达成单一的多肽长链分子，以方便表达和下游的制备处理等。但当这种scFv抗体分子研发成药物用于人体时，存在由于这15
‑
30个氨基酸柔性肽形成的非人源分子或非人源蛋白表面抗原决定簇而诱发的免疫应答，该scFv抗体分子将有可能被清除。即这种分子设计存在免疫源性的风险。
[0003]因此，本领域亟待开发一种新方法，来克服这种分子设计带来的免疫源性的风险。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是为了获得一种接近天然状态的多结构域融合分子(融合蛋白复合物)，以避免引入人工柔性肽链将各结构域连接成单一多肽分子而可能存在免疫源性的风险。组成这些接近天然状态的多结构域融合分子(融合蛋白复合物)的各元件，例如结构如式Ia或Ib所示的融合蛋白、元件A2、元件B2经过简单混合后可以形成具有生物学功能的多结构域融合分子(融合蛋白复合物)。
[0005]本专利技术的第一方面，提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白从N端到C端的结构如式Ia或Ib所示：
[0006]A1
‑
L
‑
B(Ia)；
[0007]B
‑
L
‑
A1(Ib)；
[0008]其中，
[0009]元件A1为无免疫效应的多肽分子；
[0010]元件B为特异性结合pMHC表位的多肽配体分子或其组成部分、或其片段；
[0011]元件L为柔性接头；
[0012]“‑”
为共价键。
[0013]在另一优选例中，所述融合蛋白从N端到C端的结构如式Ia所示。
[0014]在另一优选例中，所述融合蛋白中，B(特异性结合pMHC表位的多肽配体分子或其组成部分、或其片段)的N末端与A1(无免疫效应的抗体单链分子)的C末端连接。
[0015]在另一优选例中，所述的柔性接头为肽接头。
[0016]在另一优选例中，所述的肽接头具有1
‑
50个氨基酸，较佳地1
‑
20个氨基酸，较佳地1
‑
10个氨基酸，更佳地1
‑
6个氨基酸。
[0017]在另一优选例中，所述的肽接头具有(GGGGS)n的结构，其中n为1
‑
5的正整数。
[0018]在另一优选例中，所述的肽接头为GGGGS(SEQ ID No:32)。
[0019]在另一优选例中，所述元件A1选自下组：抗体的重链可变区、抗体的轻链可变区。
[0020]在另一优选例中，所述抗体中，用半胱氨酸(Cys)取代所述的抗体重链的可变区44位(Kabat计数系统，以下同)的甘氨酸(Gly)和抗体轻链的可变区100位的谷氨酰胺(Gln)。
[0021]在另一优选例中，所述抗体中，用半胱氨酸(Cys)取代所述的抗体重链的可变区105位的谷氨酰胺(Gln)和抗体轻链的可变区43位的丙氨酸(Ala)。
[0022]在另一优选例中，所述元件A1结合的是CD3抗原。
[0023]在另一优选例中，所述抗体是UCHT1。
[0024]在另一优选例中，所述抗体是OKT3。
[0025]在另一优选例中，所述抗体是12F6。
[0026]在另一优选例中，所述的抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:11所示。
[0027]在另一优选例中，所述的抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:13所示。
[0028]在另一优选例中，所述元件B选自下组：TCR分子、单链αβTCR、TCRα链/TCRβ链异二聚体、抗体分子Fab、单链抗体分子、或其组合。
[0029]在另一优选例中，所述元件B由B1和B2通过二硫键组合而成，其中B1为TCRα链，B2为TCRβ链；或者B1为TCRβ链，B2 TCRα链。
[0030]在另一优选例中，所述异二聚体的α链或β链的N末端，或单链αβTCR的N末端，或TCRα链的N末端，或TCRβ链的N末端，或抗体分子Fab的重链或轻链的N末端，或单链抗体分子的N末端，与无免疫效应的抗体单链分子的C末端氨基酸连接。
[0031]在另一优选例中，所述融合蛋白的元件B(即特异性结合pMHC表位的多肽配体分子或其组成部分、或其片段)特异性结合pMHC,元件A1(即无免疫效应的抗体单链分子)不能结合T细胞的抗原分子，或者可结合T细胞的抗原分子，但不能有效地诱导T细胞活化或产生生理效应。
[0032]在另一优选例中，所述融合蛋白与游离的另一无免疫效应的多肽结构域分子A2混合时，所述融合蛋白与A2形成融合蛋白
‑
A2复合物，所述融合蛋白
‑
A2复合物重定向T细胞，并可有效地使该重定向的T细胞活化和产生免疫生理效应。
[0033]在另一优选例中，所述的TCR分子是异二聚体αβTCR多肽对，其中所述α和β多肽各自含有TCR可变区和恒定区，但没有TCR跨膜区和胞内区。
[0034]在另一优选例中，所述的TCR分子的α和β多肽的恒定区通过用半胱氨酸(Cys)取代TRAC*01的外显子1中的第47位苏氨酸(Thr)和TRBC*01或TRBC*02的外显子1中的第56位丝氨酸(Ser)形成的二硫键连接，其中氨基酸位置编号按IMGT中列出的位置编号。
[0035]在另一优选例中，所述的TCR分子的α和β多肽的恒定区通过用半胱氨酸(Cys)取代TRAC*01的外显子1中的IMTG排序法的第52位精氨酸(Arg)和TRBC*01或TRBC*02的外显子1中的第53位丝氨酸(Ser)形成的二硫键连接。
ID NO:11所示。
[0062]在另一优选例中，所述的抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:13所示。
[0063]本专利技术的第三方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码选自下组的蛋白质或多肽：本专利技术第一方面所述的融合蛋白、元件A1、元件A2、元件B(包括B1、B2)、单链αβTCR、TCRα链、TCRβ链、抗体分子Fab、或单链抗体分子。
[0064]在另一优选例中，所述多核苷酸具有如SEQ ID N本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白从N端到C端的结构如式Ia或Ib所示：A1
‑
L
‑
B(Ia)；B
‑
L
‑
A1(Ib)；其中，元件A1为无免疫效应的多肽分子；元件B为特异性结合pMHC表位的多肽配体分子或其组成部分、或其片段；元件L为柔性接头；
“‑”
为共价键。2.如权利要求1所述融合蛋白，其特征在于，所述元件A1为抗体的重链可变区或抗体的轻链可变区。3.如权利要求1所述融合蛋白，其特征在于，所述元件B选自下组：TCR分子、单链αβTCR、TCRα链/TCRβ链异二聚体、抗体分子Fab、单链抗体分子、或其组合。4.如权利要求1所述融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:27所示。5.一种融合蛋白复合物，其特征在于，所述融合蛋白的结构如式Ic或Id所示：A2
…
A1
‑
L
‑
B(Ic)；B
‑
L
‑
A1
…
...

【专利技术属性】
技术研发人员：李懿，田野，郭韵卓，
申请(专利权)人：瑅安生物医药杭州有限公司，
类型：发明
国别省市：