一种基于牛血清白蛋白与金属离子的模拟漆酶制备及应用制造技术

本发明专利技术涉及一种基于牛血清白蛋白与金属离子自组装的漆酶模拟酶的制备及其应用，其制备步骤的特点在于，先将Cu

【技术实现步骤摘要】
一种基于牛血清白蛋白与金属离子的模拟漆酶制备及应用


[0001]本专利技术涉及仿生材料及生物化工领域，具体为一种漆酶模拟酶的制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]酚类化合物广泛应用于材料合成、杀虫剂和消毒剂等，但是自然体对这类物质的不完全消耗和过量使用，导致在土壤和自然水体中频繁检测到这类污染物的存在。据报道，酚类污染物进入人体后，可使人体出现癌症、神经毒性及内分泌紊乱等症状，对人类健康构成严重威胁。漆酶(EC.1.10.3.2)是一类含铜的胞外多酚氧化酶，其对酚类化合物具有高效的催化特异性，在水溶液中能将酚类化合物快速氧化成苯氧自由基后使其被降解，而且在反应过程中反应条件温和且对环境污染小，因此受到广泛关注。目前，利用漆酶生物降解酚类污染物的方法已被应用于低浓度含酚废水的处理过程中，并拥有较为广泛的应用前景。然而，天然漆酶作为一种活性大分子蛋白，容易受到环境温度、酸碱度和保存时间等因素的影响而失活，同时又存在着回收困难、重复利用率低和生产成本高等问题。
[0003]近几年来，一类具有天然漆酶活性的含铜配合物模拟酶，即漆酶模拟酶，被认为是天然漆酶的替代品。与天然漆酶相比，漆酶模拟酶具有生产成本低、结构稳定及催化活性高等优势，目前已被广泛应用于生物监测、生物传感及环境解毒等研究领域(专利CN113000069A)。目前，己经报道了包括卟啉类Cu配合物、酞菁Cu配合物和核苷酸基铜配合等在内的一系列关于含铜配体模拟酶具有漆酶活性(专利CN112098381A，专利CN202011262686.3，专利CN106866762A)。然而，现有的铜基漆酶模拟化合物通常存在诸如制备方法复杂，且专一性与活性无法与天然漆酶相比较(专利CN112044471A，专利CN111185229A)等问题，部分模拟酶在催化氧化酚类底物时需要过氧化氢的参与，无法很好达到替代天然漆酶的效果。因此，构建一种基于蛋白质修饰的Cu基模拟酶，成为漆酶在实际应用中的替代品，并应用于对酚类物质的催化氧化，提供一个检测酚类物质的简便快捷且绿色环保的方法具有重要意义。
[0004]本专利所公开的基于牛血清白蛋白与金属离子自组装的漆酶模拟酶可利用紫外分光光度计就能快速准确检测水中酚类污染物的含量。通过含铜人工金属模拟酶对酚类物质的催化氧化，也希望能够找到能够去除酚类污染物的简便方法，这对于生物监测、环境保护、废水处理等领域具有重大意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术旨在提供一种基于牛血清白蛋白与金属离子自组装的漆酶模拟酶的制备及其在酚类物质检测中的应用，本专利技术通过以下步骤实现：
[0006]固定牛血清白蛋白的浓度为15mg/mL，铜盐溶液浓度在10～30mM之间，常温下反应30～90min；之后加入0.5～1.5M离子液体，反应5～10h；反应结束后，离心分离得上层清液，将上清液转移到透析袋中，放于透析袋中，透析48～72h；透析后所得溶液进行冷冻干燥，称
取固体质量。
[0007]优选地，将牛血清白蛋白溶于磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，PBS缓冲液浓度为20mM，pH为7.0～7.4。
[0008]优选地，二价铜盐溶液选自硫酸铜，氯化铜，硝酸铜，醋酸铜中的一种。
[0009]优选地，离子液体选自四甲基氢氧化铵，四丁基氢氧化铵，氢氧化胆碱，乙醇胺，1
‑
乙基
‑3‑
甲基咪唑醋酸盐中的一种。
[0010]优选地，所选用的透析袋的截留分子量为10000～70000Da。
[0011]本专利技术上述方法制备得到的基于牛血清白蛋白与金属离子自组装的漆酶模拟酶(BSA
‑
Cu模拟酶)的应用：用于酚类物质的检测，测试方法为比色法。
[0012]本专利技术上述方法制备得到的基于牛血清白蛋白与金属离子自组装的漆酶模拟酶，采用比色法对酚类物质的检测时，具体方法为：室温条件下，将干燥得到的BSA
‑
Cu模拟酶分散在超纯水中，得到1mg/mL的溶液，取100μL上述溶液与700μL磷酸盐缓冲溶液用涡旋振荡迅速混合均匀，然后分别加入100μL浓度梯度范围为10
‑
100μg/mL的酚类物质以及100μL的4
‑
AP(1mg/mL)，立即用涡旋振荡混合均匀，在室温下反应30
‑
60min，用紫外分光光度计读取510nm处的吸光值，建立浓度
‑
吸光度标准曲线，得标准曲线方程。按相同方法测出该质量浓度漆酶催化酚类物质的活性，将BSA
‑
Cu模拟酶与漆酶进行活性比较。
[0013]优选地，酚类物质选自2,4
‑
二氯苯酚，苯酚，邻苯二酚，间苯二酚，萘芬中的一种。
具体实施方式
[0014]下面通过具体实施方式来进一步说明本专利技术的技术方案，但本专利技术并不限于这些实施例。
[0015]实施例1：
[0016]一种基于牛血清白蛋白与金属离子的模拟漆酶制备及应用，包括如下步骤，
[0017]固定牛血清白蛋白的浓度为15mg/mL，硫酸铜溶液浓度为10mM，常温下反应30min；之后加入0.8M四丁基氢氧化铵，反应5h；反应结束后，离心分离得上层清液，将上清液转移到透析袋中，透析48h；透析后所得溶液进行冷冻干燥，称取固体质量，即得到漆酶模拟酶。
[0018]实施例2：
[0019]同实施例1，不同之处在于，硫酸铜溶液浓度为20mM，加入1M四甲基氢氧化铵，反应6h。
[0020]实施例3：
[0021]同实施例1，不同之处在于，硫酸铜溶液浓度为30mM，常温下反应60min；之后加入1.5M氢氧化胆碱，反应10h。
[0022]实施例4：
[0023]同实施例1，不同之处在于，醋酸铜溶液浓度为20mM，常温下反应30min；之后加入1M 1
‑
乙基
‑3‑
甲基咪唑醋酸盐，反应10h。
[0024]实施例5：
[0025]同实施例1，不同之处在于，硝酸铜溶液浓度为20mM，常温下反应30min；之后加入1M乙醇胺，反应6h。
[0026]实施例6：
[0027]有关本专利技术所述方法的应用，选取实施例1制备的基于牛血清白蛋白与金属离子自组装的漆酶模拟酶(BSA
‑
Cu模拟酶)，用于2,4
‑
二氯苯酚的检测，测试方法为比色法。采用比色法对2,4
‑
二氯苯酚的检测时，具体方法为：室温条件下，将干燥得到的BSA
‑
Cu模拟酶分散在超纯水中，得到1mg/mL的溶液，取100μL上述溶液与700μL磷酸盐缓冲溶液用涡旋振荡迅速混合均匀，然后分别加入100μL浓度梯度范围为10
‑
100μg/mL的2,4
‑
二氯苯酚以及100μL的4
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AP(1mg/mL)，立即用涡旋振荡混合均匀，在室温下反应30min，溶本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于牛血清白蛋白与金属离子的模拟漆酶制备及应用，其特征在于，所述方法包括以下步骤：固定牛血清白蛋白的浓度为15mg/mL，铜盐溶液浓度在10～30mM之间，常温下反应30～90min；之后加入0.5～1.5M离子液体，反应5～10h；反应结束后，离心分离得上层清液，将上清液转移到透析袋中，透析48～72h；透析后所得溶液进行冷冻干燥，称取固体质量。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于牛血清白蛋白溶于磷酸盐缓冲溶液(PBS)中；PBS缓冲液浓度为20mM，pH为7.0～7.4。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于铜盐溶液是选自硫酸铜，氯化铜，硝酸铜，醋酸铜其中一种。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于离子液体是选自四甲基氢氧化铵，四丁基氢氧化铵，氢氧化胆碱，乙醇胺，1
‑
乙基
‑3‑
甲基咪唑醋酸盐中的一种。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所选用的透析袋的截留分子量为10000～70000Da。6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于该类漆酶模拟酶可用于酚类物质...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙剑，黄淑君，陈欣妍，贺滨，冯咪，
申请(专利权)人：北京理工大学，
类型：发明
国别省市：