氨酰-tRNA合酶突变体及烯基酪氨酰-tRNA的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种氨酰

【技术实现步骤摘要】
氨酰
‑
tRNA合酶突变体及烯基酪氨酰
‑
tRNA的制备方法


[0001]本专利技术涉及酶催化领域，具体而言，涉及一种氨酰
‑
tRNA合酶突变体及烯基酪氨酰
‑
tRNA的制备方法。

技术介绍

[0002]烯丙基在有机合成中有着广泛的应用，可以参与复分解，Diels
‑
Alder反应(双烯加成反应)，1，3
‑
偶极环加成反应(1，3
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Dipolar Cycloaddition)，已经被用于氨基酸衍生物交联反应和环肽合成。烯丙基
‑
L
‑
酪氨酸(O
‑
allyl
‑
L
‑
tyrosine，OAY)作为一种重要的非天然氨基酸，引入蛋白或者多肽中，进一步通过化学反应和其他的官能团发生反应，从而可以实现蛋白标记、蛋白和其他分子偶联的目的。通过正交的tRNA，氨酰
‑
tRNA合成酶(aaRS)和琥珀密码子(TAG)来实现非天然氨基酸的引入已被证实是一种高效可行的方案，然而由于引入的非天然氨基酸多是天然氨基酸的衍生物，导致特异性不强。

技术实现思路

[0003]本专利技术的主要目的在于提供一种氨酰
‑
tRNA合酶突变体及烯基酪氨酰
‑
tRNA的制备方法，以解决现有技术中蛋白质引入酪氨酸衍生物特异性差的问题。
[0004]为了实现上述目的，根据本专利技术的第一个方面，提供了一种氨酰
‑
tRNA合酶突变体，包括：SEQ ID NO：1所示的pNFRS的氨基酸序列发生突变的蛋白，突变选自N160突变以及如下任意一种或多种突变：A31突变为A31S、A31G、A31C、A31T或A31L；L32突变为L32G、L32S、L32C、L32T、L32V、L32A或L32I；L65突变为L65V、L65T、L65C或L65I；A67突变为A67S；L69突变为L69S、L69V或L69I；S107突变为S107R、S107A或S107T；F108突变为F108S、F108H或F108W；Q109突变为Q109G、Q109S、Q109V或Q109N；L110突变为L110R、L110Y、L110K、L110I或L110V；P158突变为P158A、P158L、P158S、P158D或P158M；L159突变为L159T、L159Q、L159E、L159V、L159D、L159I或L159A；Y161突变为Y161M、Y161Q、Y161N、Y161S、Y161W或Y161F；E162突变为E162V、E162M、E162L、E162T、E162I或E162D；N160突变为N160S、N160G、N160E、N160F、N160D、N160A、N160I、N160M、N160H或N160V。
[0005]进一步地，氨酰
‑
tRNA合酶突变体选自以SEQ ID NO：1所示的pNFRS的氨基酸序列为基础发生如下任一种组合突变的突变体，
[0006]1)A31S+L32G+P158A+L159T+N160S+Y161M+E162V；
[0007]2)A31G+L32S+L65V+L69S+S107R+F108S+Q109G+L110R+P158L+L159Q+N160G+Y161Q+E162M；
[0008]3)A31G+L32C+P158S+L159E+N160E+Y161N+E162L；
[0009]4)A31C+L32T+P158S+L159Q+N160F+Y161S+E162T；
[0010]5)A31G+L32V+L65T+A67S+S107A+F108H+Q109S+L110Y+P158D+L159V+N160D+Y161Q+E162I；
[0011]6)A31T+L32V+L65C+L69V+S107A+F108S+Q109V+L110K+P158M+L159T+N160G+Y161W
+E162T；
[0012]7)L32S+L159D+N160A+Y161S+E162T；
[0013]8)N160H+L32V+S107T+Q109N+L110I+L159I；
[0014]9)N160H+L32A；
[0015]10)N160H+L32V；
[0016]11)N160H+L32I+L65V+A67S+S107T+F108W+L110R+P158A+L159D+E162D；
[0017]12)N160H+A31L+L32A+L65I+L69I+L110V+L159A+Y161F。
[0018]为了实现上述目的，根据本专利技术的第二个方面，提供了一种DNA分子，该DNA分子编码上述氨酰
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tRNA合酶突变体。
[0019]为了实现上述目的，根据本专利技术的第三个方面，提供了一种重组质粒，该重组质粒连接有上述DNA分子。
[0020]为了实现上述目的，根据本专利技术的第四个方面，提供了一种宿主细胞，该宿主细胞内含有上述DNA分子、或上述重组质粒。
[0021]进一步地，宿主细胞包括原核细胞；优选地，原核细胞包括大肠杆菌。
[0022]为了实现上述目的，根据本专利技术的第五个方面，提供了一种烯基酪氨酰
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tRNA的制备方法，该方法包括利用上述氨酰
‑
tRNA合酶突变体，催化烯基酪氨酸和tRNA结合，制备获得烯基酪氨酰
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tRNA，烯基酪氨酸为非天然氨基酸。
[0023]进一步地，烯基酪氨酸包括烯丙基酪氨酸，进一步包括O
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烯丙基
‑
L
‑
酪氨酸。
[0024]进一步地，O
‑
烯丙基
‑
L
‑
酪氨酸的浓度为1～5mM。
[0025]进一步地，利用上述宿主细胞中含有的氨酰
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tRNA合酶突变体，催化烯基酪氨酸和tRNA结合；优选地，烯基酪氨酸溶于2～10M氢氧化钠形成烯基酪氨酸溶液，烯基酪氨酸溶液的pH为9
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11。
[0026]应用本专利技术的技术方案，利用上述氨酰
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tRNA合酶突变体，能够特异性高的识别酪氨酸衍生物，催化酪氨酸衍生物与相应的tRNA结合，形成烯基酪氨酰
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tRNA。
附图说明
[0027]构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：
[0028]图1示出了根据本专利技术实施例8的不同氨酰
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tRNA合酶突变体对应的单位菌浓荧光值的统计图。
具体实施方式
[0029]需要说明的是，在不冲本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种氨酰
‑
tRNA合酶突变体，其特征在于，包括：SEQ ID NO：1所示的pNFRS的氨基酸序列发生突变的蛋白，所述突变选自N160突变以及如下任意一种或多种突变：A31突变为A31S、A31G、A31C、A31T或A31L；L32突变为L32G、L32S、L32C、L32T、L32V、L32A或L32I；L65突变为L65V、L65T、L65C或L65I；A67突变为A67S；L69突变为L69S、L69V或L69I；S107突变为S107R、S107A或S107T；F108突变为F108S、F108H或F108W；Q109突变为Q109G、Q109S、Q109V或Q109N；L110突变为L110R、L110Y、L110K、L110I或L110V；P158突变为P158A、P158L、P158S、P158D或P158M；L159突变为L159T、L159Q、L159E、L159V、L159D、L159I或L159A；Y161突变为Y161M、Y161Q、Y161N、Y161S、Y161W或Y161F；E162突变为E162V、E162M、E162L、E162T、E162I或E162D；所述N160突变为N160S、N160G、N160E、N160F、N160D、N160A、N160I、N160M、N160H或N160V。2.根据权利要求1所述的氨酰
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tRNA合酶突变体，其特征在于，所述氨酰
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tRNA合酶突变体选自以SEQ ID NO：1所示的pNFRS的氨基酸序列为基础发生如下任一种组合突变的突变体，1)A31S+L32G+P158A+L159T+N160S+Y161M+E162V；2)A31G+L32S+L65V+L69S+S107R+F108S+Q109G+L110R+P158L+L159Q+N160G+Y161Q+E162M；3)A31G+L32C+P158S+L159E+N160E+Y161N+E162L；4)A31C+L32T+P158S+L159Q+N160F+Y161S+E162T；5)A31G+L32V+L65T+A67S+S107A+F108H+Q109S+L110Y+P158D+L159V+N160D+Y...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪浩，詹姆斯，
申请(专利权)人：凯莱英医药集团天津股份有限公司，
类型：发明
国别省市：