本发明专利技术属于生物工程领域，具体涉及转录因子MrPigB突变体及其应用。具体技术方案为：一种MrPigB突变体，在原始MrPigB基础上进行突变，突变位点包括：将原始序列中的第25号位点的谷氨酸突变为谷氨酰胺，将第32号位点的精氨酸突变为谷氨酸，将第41号位点的赖氨酸突变为天冬酰胺，将第46号位点的丝氨酸突变为苏氨酸；所述原始MrPigB的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术对转录因子MrPigB的关键位点氨基酸进行突变，获得了MrPigB突变体。首次通过突变MrPigB以提高红曲色素的产量，并有效提高红曲黄色素产量和比例。携带有突变MrPigB的红曲菌株，使红曲黄色素在总红曲色素中的比例从27％提高到72％，同时总红曲色素产量较原始菌株提高15％。菌株提高15％。
【技术实现步骤摘要】
NO.1所示，突变后的MrPigB的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，突变方式为：将原始序列中的第25号位点的谷氨酸突变为谷氨酰胺，将第32号位点的精氨酸突变为谷氨酸，将第41号位点的赖氨酸突变为天冬酰胺，将第46号位点的丝氨酸突变为苏氨酸。
[0013]下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。所获得的数据均为进行至少3次重复后获得的平均值，且各重复获得的均为有效数据。
[0014]实施例
[0015]1、将红曲菌ATCC 96218接种于PDA斜面在28℃培养7天。需要说明的是：实施例中使用的菌株为示例而非限定，本专利技术提供的方案对红曲菌具有普适性。培养完成后，刮取菌丝，加入液氮迅速研磨成粉状。加入TRIZOL溶液并震荡，静置5min后加入氯仿溶液，震荡后室温静置5min。保留上清液并加入等体积异丙醇混匀，静置沉淀RNA分子。随后离心并移除上清液，加入75％乙醇洗涤沉淀。再次移除上清液后，加入双蒸水得到总RNA溶液。采用BeyoRT
TM II cDNA合成试剂盒，以RNA为模板，制备得到cDNA。同时，采用酚氯仿法提取获得红曲菌ATCC 96218的基因组。
[0016]2、利用克隆引物(SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4)，以步骤(1)制备的cDNA为模板，通过PCR技术克隆获得MrPigB基因的编码序列。再设计一对同源臂，将用于将MrPigB突变体的DNA片段通过同源重组原理替换原始MrPigB基因，同源臂DNA片段是以红曲菌基因组为模板通过PCR技术克隆获得。
[0017]通过重叠延伸PCR法，将上下游所述同源臂片段连接到MrPigB突变体基因片段上下游，得到一个融合片段。然后通过限制性内切酶SphI将通用质粒pCB301切割得到线性质粒。利用多片段一步法克隆试剂盒(Hieff CloneTM Multi One Step Pcr Cloning Kit)将所述线性质粒与所述融合片段组装获得重组质粒，转化大肠杆菌菌株TOP10后，挑取阳性克隆提取重组质粒备用。
[0018]3、以重组质粒为模板，通过引物(SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6)以PCR技术复制整个重组质粒，将第25号位点的谷氨酸突变为谷氨酰胺。使用获得的PCR产物转化大肠杆菌菌株TOP10，挑取阳性克隆的单菌落培养后提取质粒，测序验证突变正确。以该质粒为模板，依照上述方法依次采用引物(SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12)对原始MrPigB基因进行突变，对应地分别将第32号位点的精氨酸突变为谷氨酸，将第41号位点的赖氨酸突变为天冬酰胺，将第46号位点的丝氨酸突变为苏氨酸。通过对质粒上的MrPigB基因进行测序验证突变位点。
[0019]4、将制备好的重组质粒与农杆菌感受态细胞进行混合，然后浸入液氮5min预冷，再在37℃水浴5min后，加入到新鲜LB培养基中，在28℃条件下复育5h。将复育好的菌液涂布于含有卡那霉素(50μg/mL)的LB培养基平板上。28℃培养2天后，挑取单菌落进行培养，然后提取质粒通过PCR验证确定正确的重组农杆菌。
[0020]5、使用LB培养基培养重组农杆菌至发酵液OD
600
为0.8～1.2，加入新鲜诱导培养基稀释农杆发酵液OD
600
到0.4～0.6，在28℃、150r/min下培养6h，获得农杆菌液。诱导培养基组成为：NH4NO
3 0.5g/L，NaCl0.3g/L，CaCl2·
2H2O 0.01g/L，MgSO4·
7H2O 0.6g/L，ZnSO4·
7H2O 0.5mg/L，Na2‑
EDTA
·
2H2O 1.3mg/L。
[0021]将红曲菌ATCC 96218接种到CYA培养基斜面，28℃培养5d后，用无菌水洗涤获得孢子液(5
×
105个/mL)。将制得的所述农杆菌液加入到红曲菌孢子液中至孢子液浓度为105个/mL，获得混合物。将混合物涂布于诱导培养基平板上，28℃培养2～3d。挑取单菌落挑至新鲜PDA培养基(含30mg/L潮霉素B)，28℃培养5天，随后收集菌丝，利用酚氯仿法提取基因组，通过PCR的方法使用引物(序列如SEQ ID NO.3所示)克隆得到突变MrPigBm基因片段，测序验证DNA序列的正确性，同时得到重组红曲菌株K1。
[0022]6、将原始红曲菌株ATCC 96218和重组红曲菌株K1分别接种到PDB培养基中，在28℃、150r/min下培养7天。收集菌丝体并加入80％浓度的乙醇溶液，50℃条件下提取1h。过滤除去菌丝体，收集上清液，用乙醇适当稀释后通过HPLC进行红曲色素组分分析。结果显示：原始红曲菌株ATCC 96218的红曲色素总产量为6840U/L，其中红曲黄色素占总红曲色素的质量比例为27％。携带有MrPigB突变体的重组红曲菌株K1，红曲色素总产量提高了15％，达到7870U/L；通过定量分析，红曲黄色素占总红曲色素的质量比提高到72％。
[0023]将突变体MrPigB转入其他市购红曲菌株(使用10种不同来源的红曲菌分别进行相同实验)中进行相同的对比实验，结果均显示：用MrPigB突变体替换原始MrPigB后所得的重组红曲菌株，红曲色素总产量均有显著提升，最低提升820U/L，最高提升1530U/L；同时红曲黄色素在总红曲色素中的质量占比也都提升到60％以上。
[0024]以上所述的实施例仅是对本专利技术的优选方式进行描述，并非对本专利技术的范围进行限定，在不脱离本专利技术设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本专利技术的技术方案做出的各种变形、变型、修改、替换，均应落入本专利技术权利要求书确定的保护范围内。
[0025][0026][0027][0028][0029][0030][0031][0032][0033]
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【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种MrPigB突变体，其特征在于：在原始MrPigB基础上进行突变，突变位点包括：将原始序列中的第25号位点的谷氨酸突变为谷氨酰胺，将第32号位点的精氨酸突变为谷氨酸，将第41号位点的赖氨酸突变为天冬酰胺，将第46号位点的丝氨酸突变为苏氨酸；所述原始MrPigB的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种MrPigB突变体，其特征在于：所...
【专利技术属性】
技术研发人员：李牧，段雅丽，杜芸，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：
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