对细胞进行基因修饰以递送治疗性蛋白质的方法技术

本公开提供了通过插入人工外显子(ArtEx)对细胞进行基因修饰以便在特定细胞类型中递送治疗性蛋白质的方法，并且更特别地提供了用于将转基因表达到患者大脑的工程化细胞。于将转基因表达到患者大脑的工程化细胞。于将转基因表达到患者大脑的工程化细胞。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】对细胞进行基因修饰以递送治疗性蛋白质的方法


[0001]本专利技术整体上涉及基因治疗领域，并且更具体地涉及遗传性基因疾病的治疗和预防。特别地，本公开提供了通过插入人工外显子(ArtEx)对细胞进行基因修饰以便在特定细胞类型中递送治疗性蛋白质的方法，并且更特别地提供了用于将转基因表达到患者大脑的工程化的细胞。

技术介绍

[0002]由于在通常编码酶的基因中的缺陷，先天性代谢错误是一大类单基因病症。这种遗传缺陷导致各种组织中未降解底物的积累，导致可变的临床表现，其通常会影响中枢神经系统。这些疾病的护理标准(如果可用)通常涉及静脉内递送治疗性蛋白质。这可以改善病症，因为治疗性蛋白质被受影响的细胞所吸收，从而纠正了缺陷。这种在一个细胞中制造的基因产品(或以治疗方式递送)被受影响的细胞吸收以纠正缺陷的策略被称为交叉纠正。然而，治疗性地将蛋白质递送到血浆中并不能解决在这些患者中看到的神经系统缺陷，因为该蛋白质不能穿过血脑屏障(或没有足够数量的蛋白质穿过血脑屏障)。因此，用于这些疾病的将治疗性蛋白质递送至血浆的任何治疗性策略，诸如静脉转移治疗性蛋白质或用基因疗法将肝脏或任何其它器官转换为治疗性蛋白质生产设施，将无法消散该疾病的神经症状。
[0003]因此，特别需要用于向大脑递送以治疗遗传性疾病的方法和治疗性组合物。
[0004]仅为提供信息目的而提供该背景信息。不一定承认且不应该解决任何前述信息构成针对本专利技术的现有技术。

技术实现思路

[0005]应当理解的是，上述对实施方式的一般描述以及下列详细描述均是示例性的，因此不限制实施方式的范围。
[0006]在一个方面，本专利技术提供了基因修饰的造血干细胞(HSC)，其包括在合适的基因座处共表达的治疗性基因产物，该合适的基因座在多种造血谱系中很活跃，诸如巨噬细胞，并且更特别地是填充大脑的组织驻留小胶质细胞。本文所描述的方法可以通过治疗性基因产物在髓系统和来源于它的组织中的外源性表达来治疗患者。本专利技术特别有利的是，通过从造血谱系衍生出来的填充大脑的小胶质细胞，将健康等位基因交叉表达到大脑中，以获得有害等位基因的交叉纠正。
[0007]在另一方面，本专利技术依赖于使用可编程核酸酶(诸如转录激活器样效应物核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)、簇状规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)
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Cas、大范围核酸酶和megaTAL(融合至大范围核酸酶的转录激活器样(TAL))加上用于该基因座的修复模板的递送对造血干细胞(HSC)或iPS细胞的离体修饰，修复模板提供有促进基因座的同源定向修复(HDR)的重组腺相关病毒(rAAV)。使用该策略，可以将修复模板DNA中编码的任何基因修饰并入在靶基因座处，包括并入治疗性基因产物，诸如互补DNA(cDNA)。在一些实施方式中，
治疗性基因产物将受到靶基因座的调控控制并且促进造血细胞且特别是小胶质细胞中的表达。随后通过过继细胞转移或自体HSC移植将经修饰的细胞返回到患者。该方法将全身性递送治疗性基因产物以治疗身体，并且局部递送在大脑中以治疗疾病的全部症状。
[0008]在另一方面，本专利技术提供了一种将转基因表达到患者大脑中的方法，包括：
[0009]i)获得基因修饰的造血干细胞(HSC)，其中HSC分离自患者或者获自来源于患者并且分化成HSC的诱导多能干(iPS)细胞，其中基因修饰的HSC被工程化为包括整合在小胶质细胞中表达的基因座处的转基因；和
[0010]ii)将基因修饰的HSC移植到患者中，以使其分化为将转基因表达到患者大脑中的小胶质细胞。
[0011]在另一方面，本专利技术提供了一种将转基因表达到患者大脑中的方法，包括：
[0012]i)获得基因修饰的造血干细胞(HSC)，其中HSC分离自相容供体或者获自来源于相容供体并且分化成HSC的诱导多能干(iPS)细胞，其中基因修饰的HSC被工程化为包括整合在小胶质细胞中表达的基因座处的转基因；
[0013]ii)将基因修饰的HSC移植到患者中，以使其分化为将转基因表达到患者大脑中的小胶质细胞。
[0014]在另一方面，本专利技术提供了一种分离的HSC或iPS细胞，其具有整合在选自TMEM119、CD11B、B2m、CX3CR1或S100A9的基因座处的转基因，所述转基因受所述基因的内源性启动子的转录控制。在一些实施方式中，HSC或iPS细胞用于用作药物。在一些实施方式中，HSC或iPS细胞用于在治疗在与转基因同源的内源基因的表达方面有缺陷的患者中使用(交叉纠正)。在一些实施方式中，HSC或iPS细胞用于在溶酶体贮积病的治疗中使用。
[0015]在一些实施方式中，在小胶质细胞中表达的基因座选自由以下组成的组：TMEM119、S100A9、CD11B、B2m、Cx3cr1、MERTK、CD164、Tlr4、Tlr7、Cd14、Fcgr1a、Fcgr3a、TBXAS1、DOK3、ABCA1、TMEM195、MR1、CSF3R、FGD4、TSPAN14、TGFBRI、CCR5、GPR34、SERPINE2、SLCO2B1、P2ry12、Olfml3、P2ry13、Hexb、Rhob、Jun、Rab3il1、Ccl2、Fcrls、Scoc、Siglech、Slc2a5、Lrrc3、Plxdc2、Usp2、Ctsf、Cttnbp2nl、Atp8a2、Lgmn、Mafb、Egr1、Bhlhe41、Hpgds、Ctsd、Hspa1a、Lag3、Csf1r、Adamts1、F11r、Golm1、Nuak1、Crybb1、Ltc4s、Sgce、Pla2g15、Ccl3l1、Abhd12、Ang、Ophn1、Sparc、Pros1、P2ry6、Lair1、Il1a、Epb41l2、Adora3、Rilpl1、Pmepa1、Ccl13、Pde3b、Scamp5、Ppp1r9a、Tjp1、Ak1、B4galt4、Gtf2h2、Trem2、Ckb、Acp2、Pon3、Agmo、Tnfrsf17、Fscn1、St3gal6、Adap2、Ccl4、Entpd1、Tmem86a、Kctd12、Dst、Ctsl2、Abcc3、Pdgfb、Pald1、Tubgcp5、Rapgef5、Stab1、Lacc1、Tmc7、Nrip1、Kcnd1、Tmem206、Hps4、Dagla、Extl3、Mlph、Arhgap22、Cxxc5、P4ha1、Cysltr1、Fgd2、Kcnk13、Gbgt1、C18orf1、Cadm1、Bco2、Adrb1、C3ar1、Large、Leprel1、Liph、Upk1b、P2rx7、Slc46a1、Ebf3、Ppp1r15a、Il10ra、Rasgrp3、Fos、Tppp、Slc24a3、Havcr2、Nav2、Apbb2、Clstn1、Blnk、Gnaq、Ptprm、Frmd4a、Cd86、Tnfrsf11a、Spint1、Ppm1l、Tgfbr2、Cmklr1、Tlr6、Gas6、Hist1h2ab、Atf3、Acvr1、A本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于在插入位点处将外源性编码序列整合到内源性内含子基因组区域中的方法，包括下列步骤：
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提供包括内源性内含子基因组区域的细胞，
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向所述细胞中引入包括外源性编码序列的多核苷酸模板，其中所述多核苷酸模板包括：a)第一同源多核苷酸序列，其与所述插入位点上游的内含子序列同源，b)第一强剪接位点序列，包括分支点和剪接受体；c)编码2A自切割肽的第一序列；d)编码目的蛋白质的外源序列；e)编码2A自切割肽的第二序列；f)第一外显子的编码序列的拷贝；g)包括剪接供体的第二强剪接位点序列；和h)第二同源多核苷酸序列，其与所述插入位点下游的内含子序列同源；
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诱导所述外源性多核苷酸至所述内含子序列中的整合，优选地通过同源重组，以使所述外源性编码序列在所述内源性基因座处与所述第一外显子或它的拷贝一起转录。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述整合形成人工外显子(Artex)并且被引入到造血干细胞(HSC)中，以获得所述外源性编码序列到至少一种造血细胞谱系中的表达。3.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中所述外源性编码序列编码用于治疗基因疾病的目的蛋白质。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述外源性编码序列用于在祖细胞中表达。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述外源性编码序列表达从FANCA、FANCC或FANCG中选择的蛋白质。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述外源性编码序列使所述目的蛋白质在红细胞中表达。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述外源性编码序列表达选自HBB、PKLR或RPS19中的蛋白质。8.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述外源性编码序列用于在粒细胞中表达。9.根据权利要求9所述的方法，其中所述外源性编码序列表达选自HAX1、CYBA、CYBB、NCF1、NCF2或NCF4中的蛋白质。10.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述外源性编码序列用于在巨核细胞中表达。11.根据权利要求11所述的方法，其中所述外源性编码序列表达选自因子8、因子9、因子11或WAS中的蛋白质。12.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述外源性编码序列用于在单核细胞中表达。13.根据权利要求13所述的方法，其中所述外源性编码序列表达选自IDUA、IDS、ARSB、GUSB、ABCD1、GALC、ARSA、PSAP、GBA、FUCA1、MAN2B1、AGA、ASAH1、HEXA、GAA、SMPD1、LIPA和
CDKL5中的蛋白质。14.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述外源性编码序列用于在B细胞中表达。15.根据权利要求15所述的方法，其中所述外源性编码序列表达选自ADA、IL2RG、WAS或BTK中的蛋白质。16.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述外源性编码序列用于在T细胞中表达。17.根据权利要求5所述的方法，其中所述外源性编码序列表达选自ADA、IL2RG、WAS、BTK或CCR5中的蛋白质。18.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述外源性序列的所述表达还允许所述内源性基因座的表达，尤其是所述插入位点下游的内含子序列。19.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述外源性编码序列的表达产生允许交叉纠正内源性缺陷蛋白的目的蛋白质。20.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述方法离体进行以生产工程化的治疗性细胞。21.一种插入载体，例如AAV载体，其特征在于所述载体包括用于在内源性基因座处插入的外源性多核苷酸序列，所述外源性多核苷酸序列包括下列序列：a)第一同源多核苷酸序列，其与插入位点上游的所述内含子序列同源，b)第一强剪接位点序列，包括分支点和剪接受体；c)编码2A自切割肽的第一序列；d)编码目的蛋白质的外源序列；e)编码2A自切割肽的第二序列；f)第一外显子的编码序列的拷贝；g)包括剪接供体的第二强剪接位点序列；和h)第二同源多核苷酸序列，其与所述插入位点下游的所述内含子序列同源。22.根据权利要求22所述的插入载体，其中所述第一同源序列和第二同源序列与选自以下的内源性基因座同源：tmem119、s100a9、cd11b、b2m、cx3cr1、mertk、cd164、tlr4、tlr7、cd14、fcgr1a、fcgr3a、tbxas1、dok3、abca1、tmem195、mr1、csf3r、fgd4、tspan14、tgfbri、ccr5、gpr34、serpine2、slco2b1、p2ry12、olfml3、p2ry13、hexb、rhob、jun、rab3il1、ccl2、fcrls、scoc、siglech、slc2a5、lrrc3、plxdc2、usp2、ctsf、cttnbp2nl、atp8a2、lgmn、mafb、egr1、bhlhe41、hpgds、ctsd、hspa1a、lag3、csf1r、adamts1、f11r、golm1、nuak1、crybb1、ltc4s、sgce、pla2g15、ccl3l1、abhd12、ang、ophn1、sparc、pros1、p2ry6、lair1、il1a、epb41l2、adora3、rilpl1、pmepa1、ccl13、pde3b、scamp5、ppp1r9a、tjp1、ak1、b4galt4、gtf2h2、trem2、ckb、acp2、pon3、agmo、tnfrsf17、fscn1、st3gal6、adap2、ccl4、entpd1、tmem86a、kctd12、dst、ctsl2、abcc3、pdgfb、pald1、tubgcp5、rapgef5、stab1、lacc1、tmc7、nrip1、kcnd1、tmem206、hps4、dagla、extl3、mlph、arhgap22、cxxc5、p4ha1、cysltr1、fgd2、kcnk13、gbgt1、c18orf1、cadm1、bco2、adrb1、c3ar1、large、leprel1、liph、upk1b、p2rx7、slc46a1、ebf3、ppp1r15a、il10ra、rasgrp3、fos、tppp、slc24a3、havcr2、nav2、apbb2、clstn1、blnk、gnaq、ptprm、frmd4a、cd86、tnfrsf11a、spint1、ppm1l、tgfbr2、cmklr1、tlr6、
gas6、hist1h2ab、atf3、acvr1、abi3、lrp12、ttc28、plxna4、adamts16、rgs1、icam1、snx24、ly96、dnajb4和ppfia4。23.根据权利要求22或23所述的插入，其中由所述外源性编码序列编码的所述治疗性蛋白质与IDUA、IDS、ARSB、GUSB、ABCD1、GALC、ARSA、PSAP、GBA、FUCA1、MAN2B1、AGA、ASAH1、HEXA、GAA、SMPD1、LIPA和CDKL5(SEQ ID NO:1至SEQ IDNO:35
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见表1)具有至少80％多肽序列同一性。24.一种工程化的细胞，其特征在于所述细胞根据权利要求1至21中任一项所述的一种方法可获得。25.一种工程化的细胞，其特征在于外源性多核苷酸序列被插入到内源性基因座处的内含子中，所述多核苷酸序列包括：
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【专利技术属性】
技术研发人员：亚历山大，
申请(专利权)人：塞勒克提斯公司，
类型：发明
国别省市：