一种生产D-柠檬烯的重组酵母菌株及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种生产D

【技术实现步骤摘要】
一种生产D
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柠檬烯的重组酵母菌株及其构建方法


[0001]本专利技术涉及一种生产D
‑
柠檬烯的重组酵母菌株及其构建方法，属于代谢工程


技术介绍

[0002]萜类化合物，又称类异戊二烯，由异戊二烯单元组成的化合物及其衍生物构成，是植物的次生代谢产物。柠檬烯属于单环单萜类化合物，是一种来源于植物的天然活性化合物，化学式为C
10
H
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，易挥发，性质较稳定，柠檬烯分子内只含有一个手性碳原子，因此柠檬烯有D
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柠檬烯和L
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柠檬烯两种光学异构体，以及一种外消旋体D/L
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柠檬烯，目前D
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柠檬烯在自然界存在更广泛，应用也最多。在食品工业中，D
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柠檬烯具有防腐保鲜、抑菌、抗氧化等功能；在医药行业中，D
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柠檬烯可以用于制备具有抗肿瘤、祛痰平喘、利胆溶石功能的药物；在香料、洗护行业，D
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柠檬烯可用作做精油、温和洗涤剂等；在农业方面，D
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柠檬烯可用于制备天然源农药，具有环境易降解的优点。
[0003]目前D
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柠檬烯的工业生产主要是从植物的果皮或者果肉中提取的，但提取方法存在着分离纯化复杂、产率低、能耗大等缺点，大量提取D
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柠檬烯受原料与工艺的限制。利用化学方法也能够合成柠檬烯，但化学合成法需要采用高温、高压和昂贵的催化剂，而且生产设备复杂、原料利用率低、环境污染严重。本世纪初合成生物学技术的兴起，为微生物异源合成天然活性化合物带来了全新的理念与工具，打破了物种间的界限，使微生物异源合成D
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柠檬烯成为现实。构建定向、高效的异源合成D
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柠檬烯的微生物细胞工厂，实现微生物发酵法替换传统的植物提取法和化学合成法，具有重要的经济与社会效益。目前代谢工程应用于柠檬烯的生产主要以酿酒酵母与大肠杆菌为底盘细胞，酿酒酵母作为极具潜力的细胞工厂，被广泛的应用于各种生物燃料、化工产品、医药保健品等的合成，酿酒酵母在萜类化合物的生产中应用较广泛。
[0004]Si Cheng等人通过工程改造竞争性基因ERG20的葡萄糖感应启动子HXT1以及引入由植物NPPS和植物LS利用底物NPP组成的OLB途径等策略，补料分批发酵实现柠檬烯产量917.7mg/L。胡智慧等人采用过表达或共过表达MVA关键基因、关键酶启动子优化，关键酶点突变随机突变相结、表达相关转运蛋白以增加耐受性等策略，连续发酵实现柠檬烯产量62.31mg/L。Xue Zhang等人通过设计PDH旁路简化MVA途径、弱化竞争旁路，增加胞质乙酰辅酶A含量，摇瓶补料发酵120h柠檬烯产量达到1446.56mg/L，罐上分批补料发酵实现柠檬烯产量2230mg/L，是目前国内外报道的产量最高水平。关于合成生物学的技术和方法，目前国内外现有技术柠檬烯产量无法满足工业化应用的要求。申请人在前期构建了一株重组酿酒酵母工程菌MKL8，已实现D
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柠檬烯摇瓶发酵657mg/L，该菌株生产D
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柠檬烯的能力仍有较大的提升空间。

技术实现思路

[0005]为解决上述技术问题，本专利技术提供一种生产D
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柠檬烯的重组酵母菌株，综合运用
细胞质与线粒体双重调控使柠檬烯的产量得到进一步的提升。
[0006]本专利技术的第一个目的是提供一种生产D
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柠檬烯的重组酵母菌株，所述的菌株以酿酒酵母MKL8为宿主，敲除了柠檬酸合酶基因CIT2和谷氨酸脱氢酶(NADP(+))基因GDH1，并增加了柠檬烯合酶tLimS拷贝数。
[0007]进一步地，所述的柠檬烯合酶tLimS的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]SEQ ID NO.1所示的序列：
[0009]MERRSGNYNPSRWDVNFIQSLLSDYKEDKHVIRASELVTLVKMELEKETDQIRQLELIDDLQRMGLSDHFQNEFKEILSSIYLDHHYYKNPFPKEERDLYSTSLAFRLLREHGFQVAQEVFDSFKNEEGEFKESLSDDTRGLLQLYEASFLLTEGETTLESAREFATKFLEEKVNEGGVDGDLLTRIAYSLDIPLHWRIKRPNAPVWIEWYRKRPDMNPVVLELAILDLNIVQAQFQEELKESFRWWRNTGFVEKLPFARDRLVECYFWNTGIIEPRQHASARIMMGKVNALITVIDDIYDVYGTLEELEQFTDLIRRWDINSIDQLPDYMQLCFLALNNFVDDTSYDVMKEKGVNVIPYLRQSWVDLADKYMVEARWFYGGHKPSLEEYLENSWQSISGPCMLTHIFFRVTDSFTKETVDSLYKYHDLVRWSSFVLRLADDLGTSVEEVSRGDVPKSLQCYMSDYNASEAEARKHVKWLIAEVWKKMNAERVSKDSPFGKDFIGCAVDLGRMAQLMYHNGDGHGTQHPIIHQQMTRTLFEPFA。
[0010]进一步地，所述的柠檬烯合酶tLimS基因通过诱导型启动子GAL10进行表达。
[0011]进一步地，所述的柠檬烯合酶tLimS的表达位点为酿酒酵母基因组的1021b位点、208a位点、308a位点、720a位点、YPRCδ15c位点、1014a位点中的至少两处。
[0012]进一步地，所述的柠檬烯合酶tLimS的拷贝数由2增加至6。
[0013]进一步地，所述的柠檬酸合酶基因的NCBI编号为NP 009931.1，所述的谷氨酸脱氢酶(NADP(+))基因的NCBI编号为NP_015020.3，所述的柠檬烯合酶基因的NCBI编号为AAC37366.1。此处柠檬烯合酶基因是未截短的序列。
[0014]进一步地，所述的重组酵母菌株还包括将柠檬烯合成途径酶定位至线粒体表达。
[0015]进一步地，所述的柠檬烯合成途径酶包括甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因IDI、截短的3
‑
羟基
‑3‑
甲基戊二酰辅酶A还原酶基因tHMG1、乙酰乙酰辅酶A硫解酶基因ERG10、β
‑
羟
‑
β
‑
甲戊二酸单酰辅酶a合酶基因ERG13、甲羟戊酸激酶基因ERG12、磷酸甲羟戊酸ERG8和焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶ERG19、法尼基焦磷酸合酶突变体基因ERG20ww和柠檬烯合酶基因tLimS。
[0016]进一步地，所述的截短的3
‑
羟基
‑3‑
甲基戊二酰辅酶A还原酶基因tHMG1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0017]SEQ ID NO.2所示的序列：
[0018]atggaccaattggtgaaaactgaagt本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生产D
‑
柠檬烯的重组酵母菌株，其特征在于，所述的菌株以酿酒酵母MKL8为宿主，敲除了柠檬酸合酶基因CIT2和谷氨酸脱氢酶(NADP(+))基因GDH1，并增加了柠檬烯合酶tLimS拷贝数。2.根据权利要求1所述的重组酵母菌株，其特征在于，所述的柠檬烯合酶tLimS的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。3.根据权利要求1所述的重组酵母菌株，其特征在于，所述的柠檬烯合酶tLimS基因通过诱导型启动子GAL10进行表达。4.根据权利要求1所述的重组酵母菌株，其特征在于，所述的柠檬烯合酶tLimS的表达位点为酿酒酵母基因组的1021b位点、208a位点、308a位点、720a位点、YPRCδ15c位点、1014a位点中的至少两处。5.根据权利要求1所述的重组酵母菌株，其特征在于，所述的柠檬烯合酶tLimS的拷贝数由2增加至6。6.根据权利要求1所述的重组酵母菌株，其特征在于，所述的重组酵母菌株还包括将柠檬烯合成途径酶定位至线粒体表达。7.根据权利要求1所述的重组酵母菌株，其特征在于，所述的柠檬烯合成途径酶包括甲羟戊酸焦磷酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘龙，孙正艳，陈坚，崔佳，吕雪芹，堵国成，方杰，李江华，董金儒，刘延峰，孔晓，
申请(专利权)人：鄂尔多斯市中轩生化股份有限公司，
类型：发明
国别省市：