编码ND4的核酸及其用途制造技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，尤其涉及编码ND4的核酸及其用途。本发明专利技术对ND4的编码核酸序列进行了密码子优化，实验表明，采用本发明专利技术优化后序列制备获得的药物处理可以显著改善ND4突变导致的病人细胞的线粒体功能紊乱病变。变。

【技术实现步骤摘要】
编码ND4的核酸及其用途


[0001]本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及编码ND4的核酸及其用途。

技术介绍

[0002]NADH泛醌氧化还原酶4号亚基(NADH
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ubiquinone oxidoreductase chain 4，ND4)是线粒体complex I(1号复合体)的核心亚基，它与其他六个亚基共同构成了complex I的疏水区段。Complex I在线粒体呼吸链中扮演重要角色，它能够氧化三羧酸循环和β
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氧化产生的NADH，还原泛醌，提供质子运输的动力，从而帮助质子跨过线粒体内膜。线粒体DNA11778位点突变由线粒体DNA(mtDNA)第11778位核苷酸发生突变引起的，此突变使呼吸链上ND4基因编码的第340位氨基酸由精氨酸变为组氨酸。虽然它们均为碱性氨基酸，但这一位置的精氨酸是高度保守的。由于突变可能降低电子流动效率影响酶的活性从而减少视神经细胞ATP的产生，细胞逐渐凋亡，从而导致患者发生Leber遗传性视神经病变LHON。
[0003]Leber遗传性视神经病变(LHON)是一种由线粒体基因组点突变引起的母系遗传性疾病，全球发病率为1/30000。LHON患者的特征为：一般20
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30岁发病，随着病程发展，患者的双侧视力急剧下降，直至最终失明。主要病因是由于患者视网膜神经节细胞(RGCs)死亡，而RGC细胞的死亡要归因于患者的线粒体基因突变。大多数与LHON相关的突变发生在complex I各亚基的编码基因内，其中超过一半的突变发生于ND4的G11778A位点上。该突变占中国LHON患者的89.2％，且预后最差。
[0004]目前传统的药物对治疗LHON患者作用有限，而AAV介导的基因治疗在针对这类单基因突变的遗传疾病方面展现出巨大的潜力。但AAV介导的基因治疗的效果依赖于基因序列，野生型AAV基因序列在以往的治疗中表现出的疗效仍存在提高空间。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供编码ND4(NADH泛醌氧化还原酶4号亚基)的核酸及其用途，以期提高ND4的表达水平，提高治疗效果。
[0006]本专利技术提供了编码NADH泛醌氧化还原酶4号亚基的核酸，包括I)～III)中至少一种：
[0007]I)、具有如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的核酸；
[0008]II)、与如I)所示的核苷酸序列具有至少70％同源性的序列且编码如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白的核酸；优选为具有至少80％同源性；更优选为具有至少85％同源性；更优选为具有至少90％同源性；更优选为具有至少95％同源性；更优选为具有至少96％同源性；更优选为具有至少97％同源性；更优选为具有至少98％同源性；更优选为具有至少99％同源性；
[0009]III)、与I)或II)部分互补或完全互补的核酸。
[0010]本专利技术还提供了NADH泛醌氧化还原酶4号亚基的转录单元，其包括：启动子、本专利技术所述的编码NADH泛醌氧化还原酶4号亚基(ND4)的核酸和终止子。
[0011]本专利技术所述转录单元的其5
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端至3
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端依次包括：启动子、编码ND4的核酸、调控片段和终止子。本专利技术中，所述调控片段选自COX10 UTR或SV40信号片段。一些实施例中，所述转录单元的5
’
端至3
’
端依次包括CMV增强子、CMV启动子、Chimeric intron、MTS片段、SEQ ID NO:1所示序列的核酸片段、标签片段和SV40信号片段。
[0012]本专利技术所述的重组载体，其包括骨架载体和本专利技术所述的核酸。
[0013]本专利技术所述的重组载体为病毒载体；所述病毒载体选自DNA病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体中至少一种；其中，腺相关病毒载体的血清型为AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或AAV9。本专利技术所述重组载体的骨架载体为pAAV2。
[0014]一些实施例中，所述重组载体包括顺序连接的：包括顺序连接的AAV2 5
’
ITR、CMV增强子、CMV启动子、Chimeric intron、MTS片段、SEQ ID NO:1所示序列的核酸片段、标签片段、SV40信号片段、AAV2 3
’
ITR。
[0015]本专利技术所述的核酸、转录单元、所述的重组载体在制备防治线粒体功能紊乱病变的药物中的应用。本专利技术所述的防治包括预防和/或治疗。本专利技术所述防治线粒体功能紊乱病变为视神经病变；一些实施例中，所述视神经病变为遗传性视神经病变。一些具体实施例中，本专利技术提供了所述的核酸、转录单元、所述的重组载体在制备防治Leber遗传性视神经病变的药物中的应用。
[0016]本专利技术还提供了一种药物，其包括：本专利技术所述的核酸、转录单元或所述的重组载体，还可以包括药学上可接受的载体和赋形剂。
[0017]本专利技术所述的药物中包括：所述重组载体、Lipofectamine 2000试剂和无血清DMEM培养基。一些实施例中，所述重组载体的浓度为0.8μg/100μL～1.0μg/100μL。
[0018]本专利技术还提供了一种药物的递送方法，其将本专利技术所述的药物制剂注射至眼部，优选地为玻璃体腔注射。
[0019]本专利技术还提供了一种防治治疗Leber遗传性视神经病变的方法，其为给予本专利技术所述的药物。所述给予的方式为玻璃体腔注射。
[0020]本专利技术对ND4的编码核酸序列进行了密码子优化，实验表明，采用本专利技术优化后序列制备获得的药物处理可以显著改善ND4突变导致的病人细胞的线粒体功能紊乱病变。用AAV2
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CMV
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ND4opt3药物处理293细胞，优化后ND4可以在该细胞系中高效表达，且表达效率高于未优化的ND4序列。同时，病人细胞经AAV2
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CMV
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ND4opt3药物处理后，恢复了在半乳糖培养基生长的能力，产生ATP的能力得到了改善并接近野生型细胞，证明其线粒体功能紊乱得到了修正。因此此AAV2
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CMV
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ND4opt3药物具有预防或治疗Leber遗传性视神经病变的作用。
附图说明
[0021]图1、图1续示rND4和ND4 opt3序列比对：优化后差异性的密码子序列加粗并用下划线标注；
[0022]图2示质粒载体图谱，其中,A示pAAV2
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CMV
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rND4
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COX10UTR
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SV40载体图谱，B示pAAV2
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CMV
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ND4opt3
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SV40载体图谱，载体包含AAV2 5
’
ITR，CMV增强子，CMV启动子，嵌合内含子，MTS(线粒体靶向序列)，密本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.编码ND4的核酸，包括I)～III)中至少一种：I)、具有如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的核酸；II)、与如I)所示的核苷酸序列具有至少90％同源性的序列且编码如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白的核酸；III)、与I)或II)完全互补的核酸。2.ND4的转录单元，其包括：启动子、权利要求1所述的核酸和终止子。3.根据权利要求2所述的转录单元，其特征在于，其5
’
端至3
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端依次包括：启动子、权利要求1所述的核酸、调控片段和终止子。4.重组载体，其包括骨架载体和权利要求1所述的核酸。5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，其为病毒载体；所述病毒载体选自DNA病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体中至少一种；其中，腺相关病毒载体的血清型为AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或AAV9。6.根据权利要求4或5所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：李斌，肖溯，
申请(专利权)人：纽福斯苏州生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：