一种烟草NtDSR1基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种烟草NtDSR1基因及其应用。与对照K326相比，NtDSR1基因过表达烟草植株表现出较强的青枯病抗性。烟草NtDSR1基因在烟草青枯病抗性调控过程中发挥重要作用，可应用于烟草青枯病抗性改良的基因功能研究和基因工程育种。因工程育种。

【技术实现步骤摘要】
一种烟草NtDSR1基因及其应用


[0001]本专利技术属于烟草基因工程
，具体涉及一种与植物青枯病抗性相关的烟草NtDSR1基因及其在调控烟草青枯病抗性中的应用。

技术介绍

[0002]烟草青枯病是青枯雷尔式菌(Ralstonia solanancearum)引起的一种细菌性土传病害，在烟草苗期和大田期发生，严重影响了烟草的生长发育，对烟叶生产造成严重经济损失。烟草青枯病的防治包括化学、农业和生物防治等方法，目前这些方法仍不能有效解决问题。在烟草等作物中，挖掘并利用青枯病抗性基因是防治青枯病的根本的途径。利用基因工程相关技术，从烟草中分离出青枯病抗性相关基因并将其应用到青枯病抗性烟草分子育种中，对于保证烟草的品质和产量具有重要的现实意义。
[0003]本专利技术首次在烟草中发现了一个与烟草青枯病相关的DSR基因，即烟草NtDSR1基因，为烟草抗青枯病提供新的途径。

技术实现思路

[0004]本专利技术的首要目的在于提供一个与烟草青枯病抗性相关的烟草NtDSR1基因，利用烟草青枯病抗性相关的NtDSR1基因所构建重组过表达载体转化烟草，提高NtDSR1基因表达量进而能够增强烟草对青枯病的抗性，从而为提高烟草青枯病抗性以及烟草青枯病抗性育种提供育种中间材料。
[0005]一种烟草NtDSR1基因，基因CDS序列如SEQ ID NO.1所示。
[0006]进一步的，所述的基因序列还包括相似性不低于95％的具有类似功能的基因序列；所述的类似功能包括表达抗青枯病的蛋白。
[0007]进一步的，所述的抗青枯病的具体对象为植物，进一步优选为烟草。
[0008]本专利技术的第二个目的是提供一种NtDSR1蛋白，蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009]进一步的，所述的蛋白序列还包括相似性不低于95％的具有类似功能的蛋白序列；所述的类似功能包括抗青枯病。
[0010]进一步的，所述的抗青枯病的具体对象为植物，进一步优选为烟草。
[0011]本专利技术的第三个目的是提供所述的烟草NtDSR1基因在提高青枯病抗性中的应用。
[0012]进一步的，用于提高植物抗青枯病抗性，尤其是烟草抗青枯病抗性。
[0013]进一步的，通过过表达烟草NtDSR1基因，获得烟草青枯病抗性提高的烟草转化植株。
[0014]进一步的，过表达烟草NtDSR1基因的载体为pCHF3。
[0015]所述重组过表达载体pCHF3为双元农杆菌载体。构建重组表达载体时，将NtDSR1基因碱基序列插入花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子之后。
[0016]本专利技术使用的载体包括但不限于pCHF3，只要满足在烟草中正常表达NtDSR1基因的载体均可。
[0017]所述转化烟草为使用含有重组过表达载体的农杆菌侵染烟草愈伤组织，利用农杆菌介导的转化方法，将花椰菜花叶病毒35S启动子和烟草NtDSR1基因整合进烟草基因组。在烟草内，通过对NtDSR1基因过表达，提高烟草的青枯病抗性。
[0018]本专利技术首次在烟草中完成了NtDSR1基因的克隆、表达和功能分析，分析结果表明该基因与烟草的青枯病抗性应答相关。此外，在烟草中过表达NtDSR1基因可明显提高烟草的青枯病抗性，从而为提高烟草青枯病抗性以及烟草青枯病抗性育种提供材料。
附图说明
[0019]图1烟草NtDSR1基因克隆PCR扩增产物电泳图；
[0020]图1中M为2000bp DNA maker；1为阴性对照；2为NtDSR1基因扩增结果。
[0021]图2烟草接种青枯病后NtDSR1基因表达模式分析；
[0022]图2中mock表示对照；
[0023]图3烟草NtDSR1基因过表达烟草植株中NtDSR1的表达量分析；
[0024]图4烟草NtDSR1基因过表达烟草植株和K326对照的青枯病抗性评价；
[0025]图5烟草NtDSR1基因过表达烟草植株和K326对照的烟草根部青枯病病原菌繁殖情况。
具体实施方式
[0026]下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中所涉及部分生物材料、实验试剂、实验仪器等基本情况简要介绍如下。生物材料：
[0027]烟草材料，栽培烟草(Nicotiana tabacum)品种K326(常见烟草主栽品种)保存于本实验室。过量表达烟草基因所用到的载体质粒pCHF3购买自武汉普因特生物工程有限公司。
[0028]实验试剂：
[0029]本实验开展过程中所使用的试剂及试剂盒如下：限制性内切酶购于NEB(北京)有限公司；RNA提取TRIzol试剂盒购于康为世纪生物科技有限公司；高保真DNA扩增酶、反转录试剂盒和荧光定量试剂盒购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司；DNA凝胶回收试剂盒MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit、质粒DNA小量纯化试剂盒MiniBEST Plasmid purification Kit购买于Invitrogen公司；卡那霉素、利福平等抗生素购于上海生工生物工程有限公司。
[0030]实施例1
[0031]本实施例主要就NtDSR1基因的获得过程简要介绍说明如下。
[0032]1、总RNA提取
[0033]采用康为世纪公司的TRIzol试剂提取法提取RNA，具体步骤如下：在正常生长条件下，生长4周的栽培烟草K326取材后迅速在液氮中研磨成粉末状，每30
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50mg组织加入1ml TRIzon Reagent(cwbiotech)，混匀；室温放置5min后，加入200μl氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置2min。4℃12,000rpm离心10分钟，小心取出上层水相，转入另一离心管中，加入等体积的70％乙醇。将混合液全部转移到吸附柱中，12,000rpm离心20秒，倒掉收集管中的废液，加入700μl Buffer RW1，12,000rpm离心20秒，倒掉收集管中的废液。加入500μl Buffer RW2，
12,000rpm离心20秒，倒掉收集管中的废液。空离2min，倒掉收集管中的废液，室温放置5min，加入30μl水，室温放置1分钟，12,000rpm离心1分钟，收集RNA溶液，
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70℃保存RNA，防止降解。所提RNA经DNA酶(Fermentas)处理。
[0034]2、反转录反应
[0035]反转录步骤采取诺唯赞公司R323试剂盒，具体步骤如下：取1μg K326总RNA进行反转录，加入4
×
gDNA wiper Mix 4μl，加入去离子水补足到16μl；42℃保温2min后，加入4μl的5
×
HiScript III qRT SuperMix，反应终体积为20μl；37℃反应15min，85℃加热5s终止反应。获得的cDNA在
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20℃保存。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种烟草NtDSR1基因，其特征在于，基因CDS序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的烟草NtDSR1基因，其特征在于，所述的基因序列还包括相似性不低于95％的具有类似功能的基因序列；所述的类似功能包括表达抗青枯病的蛋白。3.根据权利要求2所述的烟草NtDSR1基因，其特征在于，所述的抗青枯病的具体对象为植物，进一步优选为烟草。4.一种NtDSR1蛋白，其特征在于，蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。5.根据权利要求4所述的NtDSR1蛋白，其特征在于，所述的蛋白序列还包括相似性不低于95％的具有类...

【专利技术属性】
技术研发人员：王东，李晓旭，蒲文宣，刘万峰，周文辉，张新要，黄平俊，陈凯，何鑫玺，
申请(专利权)人：湖南中烟工业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：