一种利用固定化酶合成苯丙醇衍生物的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用固定化酶合成苯丙醇衍生物的方法，包括如下步骤：步骤一，提取羧酸还原酶、乙醇脱氢酶、烯键还原酶的基因，获得工程菌，破碎分离后得到羧酸还原酶、乙醇脱氢酶、烯键还原酶；步骤二，利用交联法固定化酶，得到固定化的羧酸还原酶、固定化的乙醇脱氢酶、固定化的烯键还原酶；步骤三，利用固定化酶及辅酶制备利用本发明专利技术合成技术得到的苯丙醇衍生物纯度高，且本方法简单，能耗低。耗低。耗低。

【技术实现步骤摘要】
一种利用固定化酶合成苯丙醇衍生物的方法


[0001]本专利技术涉及生物工程
，特别是一种利用固定化酶合成苯丙醇衍生物的方法。

技术介绍

[0002]苯丙醇及其衍生物是医药、食品、饲料、化妆品等多个领域产品的重要原料，以苯丙醇为例，天然存在于草莓、茶叶、桂叶油等物质中。在食品工业中苯丙醇是被允许使用的食品用香料；在化妆品行业中，可作为防腐剂进行添加；在医药领域，苯丙醇是中枢骨胳肌松弛剂强盘松的中间体。
[0003]苯丙醇及其衍生物拥有诸多的功效、应用，但目前获取的方式仍然局限于肉桂酸乙酯、桂醇等原料通过加氢等反应进行生产，该过程工艺复杂、能耗过高，不符合当今环保、绿色生产的理念，市场需要一种通过生物工程
的方法，利用简单的工艺及较低的能耗得到苯丙醇及其衍生物，本专利技术解决这样的问题。

技术实现思路

[0004]为解决现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种利用固定化酶合成苯丙醇衍生物的方法，合成技术简单，能耗低，得到的苯丙醇衍生物纯度高。
[0005]为了实现上述目标，本专利技术采用如下的技术方案：
[0006]一种利用固定化酶合成苯丙醇衍生物的方法，包括如下步骤：
[0007]步骤一，制备羧酸还原酶、乙醇脱氢酶、烯键还原酶：
[0008]提取羧酸还原酶的基因，经过聚合酶链式反应扩增后，制备重组表达质粒，将重组表达质粒导入大肠杆菌中进行培养，获得重组表达的工程菌，将工程菌破碎分离，收集羧酸还原酶；
[0009]提取乙醇脱氢酶的基因，经过扩增后，制备重组表达质粒，将重组表达质粒导入大肠杆菌中进行培养，获得重组表达的工程菌，将工程菌破碎分离，收集乙醇脱氢酶；
[0010]提取烯键还原酶的基因，经过扩增后，制备重组表达质粒，将重组表达质粒导入大肠杆菌中进行培养，获得重组表达的工程菌，将工程菌破碎分离，收集烯键还原酶；
[0011]步骤二，利用交联法固定化酶，得到固定化的羧酸还原酶、固定化的乙醇脱氢酶、固定化的烯键还原酶；
[0012]步骤三，利用固定化酶及辅酶制备
[0013]将腺嘌呤核苷三磷酸ATP、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷
酸NADPH、黄素单核苷酸FMN以质量比为1：(1
‑
2)：(1
‑
12)：(1
‑
3)的比例溶解形成溶液，将溶液依次通过经固定化处理的羧酸还原酶、经固定化处理的乙醇脱氢酶、经固定化处理的烯键还原酶处理得到粗产物；调节所得的粗产物的pH值为5
‑
8，并经过搅拌、抽滤、洗涤、干燥后得到纯化的
[0014]R1包括：
‑
CH3、
‑
OH、
‑
H或
‑
OCH3；
[0015]R2包括：
‑
CH3、
‑
OH、
‑
H或
‑
OCH3；
[0016]R3包括：
‑
CH3、
‑
OH、
‑
H或
‑
OCH3。
[0017]前述的一种利用固定化酶合成苯丙醇衍生物的方法，提取羧酸还原酶的基因的来源包括：Mycobacterium marinum的HXW97
‑
RS16665，序列为SEQ01，或Mycobacterium paraintracellulare的OCQ
‑
RS16610，序列为SEQ02；所述提取乙醇脱氢酶的基因的来源包括：Saccharomyces cerevisiae的ADH1，序列为SEQ03，或Fusarium subglutinans的FSUBG
‑
7421，序列为SEQ04；所述提取烯键还原酶的基因的来源包括：Tarenaya hassleriana的LOC104820880，序列为SEQ05，或Camelina sativa的LOC1047699854，序列为SEQ06。
[0018]前述的一种利用固定化酶合成苯丙醇衍生物的方法，步骤一种聚合酶链式反应扩增的PCR反应体系包括：10
×
PCR buffer 20ul，dNTP 16ul，正向引物6ul，反向引物6ul，Taq DNA聚合酶10ul，dd H2O 140ul，模板DNA 0.1
‑
2ug；扩增程序及条件：为94℃预变性3min；随后35个循环，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s；最后72℃延伸5min。
[0019]前述的一种利用固定化酶合成苯丙醇衍生物的方法，正向引物包括：HXW97
‑
RS16665的正向引物的序列为SEQ07，OCQ
‑
RS16610的正向引物的序列为SEQ08，ADH1的正向引物的序列为SEQ09，FSUBG
‑
7421的正向引物的序列为SEQ10，LOC104820880的正向引物的序列为SEQ11，LOC1047699854的正向引物的序列为SEQ12；
[0020]反向引物包括：HXW97
‑
RS16665的反向引物的序列为SEQ13，OCQ
‑
RS16610的反向引物的序列为SEQ14，ADH1的反向引物的序列为SEQ15，FSUBG
‑
7421的反向引物的序列为SEQ16，LOC104820880的反向引物的序列为SEQ17，LOC1047699854的反向引物的序列为SEQ18。
[0021]前述的一种利用固定化酶合成苯丙醇衍生物的方法，步骤一中获得重组表达的工程菌的具体方法是：取由CaCl2处理过的感受态大肠杆菌菌悬液，加入重组质粒溶液，再加入培养基，使细菌恢复正常生长状态；将培养后的菌液涂布于筛选平板上，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，继续培养；从筛选平板上挑取新活化的单个菌落，接种于培养基中培养，直至对数生长后期；将该菌悬液接种于培养基中培养至OD600＝0.5。
[0022]前述的一种利用固定化酶合成苯丙醇衍生物的方法，步骤二中利用交联法固定化酶，得到固定化的羧酸还原酶、固定化的乙醇脱氢酶、固定化的烯键还原酶的具体方法为：
[0023]将偶联剂加入含有二氧化硅载体的胶体溶液中，获得改性后的二氧化硅载体；将改性后的二氧化硅载体和所述羧酸还原酶MavCAR加入到去离子水、醋酸盐和磷酸盐的缓冲溶液中，调节溶液pH值在5
‑
8，再经过洗涤、过滤、干燥后获得固定化的羧酸还原酶。
[0024]将偶联剂加入含有二氧化硅载体的胶体溶液中，获得改性后的二氧化硅载体；将
改性后的二氧化硅载体和所述乙醇脱氢酶ADH加入到去离子水、醋酸盐和磷酸盐的缓冲溶液中，调节溶液pH值在5
‑
8，再经过洗涤、过滤、干燥后获得固定化的乙醇脱氢酶。
[0025]将交联剂加入含有二氧化硅载体的胶体溶液中，获得改性后的二氧本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用固定化酶合成苯丙醇衍生物的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一，制备羧酸还原酶、乙醇脱氢酶、烯键还原酶：提取羧酸还原酶的基因，经过聚合酶链式反应扩增后，制备重组表达质粒，将重组表达质粒导入大肠杆菌中进行培养，获得重组表达的工程菌，将工程菌破碎分离，收集羧酸还原酶；提取乙醇脱氢酶的基因，经过扩增后，制备重组表达质粒，将重组表达质粒导入大肠杆菌中进行培养，获得重组表达的工程菌，将工程菌破碎分离，收集乙醇脱氢酶；提取烯键还原酶的基因，经过扩增后，制备重组表达质粒，将重组表达质粒导入大肠杆菌中进行培养，获得重组表达的工程菌，将工程菌破碎分离，收集烯键还原酶；步骤二，利用交联法固定化酶，得到固定化的羧酸还原酶、固定化的乙醇脱氢酶、固定化的烯键还原酶；步骤三，利用固定化酶及辅酶制备将腺嘌呤核苷三磷酸ATP、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADPH、黄素单核苷酸FMN以质量比为1：(1
‑
2)：(1
‑
12)：(1
‑
3)的比例溶解形成溶液，将溶液依次通过经固定化处理的羧酸还原酶、经固定化处理的乙醇脱氢酶、经固定化处理的烯键还原酶处理得到粗产物；调节所得的粗产物的pH值为5
‑
8，并经过搅拌、抽滤、洗涤、干燥后得到纯化的R1包括：
‑
CH3、
‑
OH、
‑
H或
‑
OCH3；R2包括：
‑
CH3、
‑
OH、
‑
H或
‑
OCH3；R3包括：
‑
CH3、
‑
OH、
‑
H或
‑
OCH3。2.根据权利要求1所述的一种利用固定化酶合成苯丙醇衍生物的方法，其特征在于，所述提取羧酸还原酶的基因的来源包括：Mycobacterium marinum的HXW97
‑
RS16665，序列为SEQ01，或Mycobacterium paraintracellulare的OCQ
‑
RS16610，序列为SEQ02；所述提取乙醇脱氢酶的基因的来源包括：Saccharomyces cerevisiae的ADH1，序列为SEQ03，或Fusarium subglutinans的FSUBG
‑
7421，序列为SEQ04；所述提取烯键还原酶的基因的来源包括：Tarenaya hassleriana的LOC104820880，序列为SEQ05，或Camelina sativa的LOC1047699854，序列为SEQ06。3.根据权利要求1所述的一种利用固定化酶合成苯丙醇衍生物的方法，其特征在于，所述步骤一种聚合酶链式反应扩增的PCR反应体系包括：10
×
PCR buffer 20ul，dNTP 16ul，正向引物6ul，反向引物6ul，Taq DNA聚合酶10ul，dd H2O 140ul，模板DNA 0.1
‑
2ug；扩增程序及条件：为94℃预变性3min；随后35个循环，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s；最
后72℃延伸5min。4.根据权利要求3所述的一种利用固定化酶合成苯丙醇衍生物的方法，其特征在于，所述正向引物包括：HXW97
‑
RS16665的正向引物的序列为SEQ07，OCQ
‑
RS16610的正向引物的序列为SEQ08，ADH1的正向引物的序列为SEQ09，FSUBG
‑
7421的正向引物的序列为SEQ10，LOC10482088...

【专利技术属性】
技术研发人员：占纪勋，陶福平，张炜，
申请(专利权)人：杭州唯铂莱生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：