神经元细胞与小胶质细胞/巨噬细胞、T细胞共培养体系及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种神经元细胞与小胶质细胞/巨噬细胞、T细胞共培养体系及其构建方法与应用；共培养体系包括神经元细胞、小胶质细胞/巨噬细胞和T细胞，神经元细胞、小胶质细胞/巨噬细胞和T细胞来源于基因敲除小鼠和野生型小鼠，体系为体外培养体系；构建方法包括：磁珠分选T细胞，原代培养小胶质细胞/巨噬细胞，原代培养神经元细胞，神经元细胞与小胶质细胞/巨噬细胞、T细胞共培养；应用：用于体外实验研究TIM

【技术实现步骤摘要】
神经元细胞与小胶质细胞/巨噬细胞、T细胞共培养体系及其构建方法与应用


[0001]本专利技术涉及细胞生物学领域，尤其涉及一种神经元细胞与小胶质细胞/巨噬细胞、T细胞共培养体系及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]缺血性脑卒中的发病率、致残率及死亡率均高。因其严格的治疗时间窗、昂贵的医疗费用和沉重的社会负担受到人们极大的关注。虽然缺血区血管可自然或医源性再通而恢复血液灌注，然而部分细胞的功能障碍或结构破坏却进一步加重，即发生脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI)，而如何有效地减轻CIRI是提高急性缺血性脑卒中疗效的关键因素之一。
[0003]然而，CIRI病理机制复杂，越来越多的研究显示炎症
‑
免疫反应贯穿CIRI的发生、发展全过程，其中单核巨噬细胞表型转换在缺血性脑卒中急性期的炎症反应发挥极其重要的作用。但其机制目前尚不明确。中枢神经系统的单核巨噬细胞即小胶质细胞，是脑实质内唯一的固有免疫细胞。脑缺血数分钟后，神经元坏死，小胶质细胞被激活，血液内的单核细胞被招募、迁移至脑缺血半暗带区，活化为小胶质细胞/巨噬细胞。
[0004]T细胞免疫球蛋白粘蛋白分子4(T cell immunoglobulin and mucin
‑
domain
‑
containing molecule 4，TIM4)是近年新发现的TIM蛋白家族成员，有研究表明TIM
‑
4在肝脏和肾脏的缺血再灌注损伤中起着重要作用，但其对脑缺血再灌注损伤的影响尚不清楚。因此，构建一种神经元细胞与小胶质细胞/巨噬细胞、T细胞共培养体系，从而进一步研究TIM
‑
4通过调控炎症
‑
免疫反应参与CIRI的作用机制是亟待解决的问题。

技术实现思路

[0005]本专利技术要解决的技术问题在于，针对上述现有技术的缺陷，提供一种神经元细胞与小胶质细胞/巨噬细胞、T细胞共培养体系及其构建方法与应用。
[0006]本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种神经元细胞与小胶质细胞/巨噬细胞、T细胞共培养体系，所述体系包括神经元细胞、小胶质细胞/巨噬细胞和T细胞；所述神经元细胞、小胶质细胞/巨噬细胞和T细胞来源于基因敲除小鼠和野生型小鼠；所述体系为体外培养体系。
[0007]本专利技术还提供一种神经元细胞与小胶质细胞/巨噬细胞、T细胞共培养体系的构建方法，包括以下步骤：
[0008]S1、磁珠分选T细胞：
[0009]S1.1、无菌条件下分离出生1
‑
3天的小鼠淋巴器官并制备单细胞悬液，去除红细胞，细胞混悬后计数；
[0010]S1.2、在S1.1步骤所得的细胞悬液中加入一抗孵育，离心并弃上清，沉淀混悬；
[0011]S1.3、在S1.2步骤所得的细胞悬液中加入MACS磁珠孵育，离心并弃上清，沉淀混悬
后进行分离并洗脱；
[0012]S1.4、将S1.3步骤所得的细胞悬液离心并弃上清，沉淀混悬后计数，即获得带磁珠的分选T细胞；
[0013]S2、原代培养小胶质细胞/巨噬细胞：
[0014]S2.1、无菌条件下分离出生1
‑
3天的小鼠脑组织并剪碎，加入消化试剂；
[0015]S2.2、在S2.1步骤的脑组织中加入完全培养基终止消化，离心弃上清，沉淀物重悬于完全培养基，静置，去除成纤维细胞，得到第一细胞悬液；
[0016]S2.3、将S2.2步骤所得的第一细胞悬液接种于第一细胞培养瓶，第一次培养后换液，进行第二次培养，分离小胶质细胞/巨噬细胞悬液并进一步纯化小胶质细胞/巨噬细胞，随后进行第三次培养，得到混合细胞；
[0017]S2.4、对S2.3步骤所得的混合细胞用大鼠抗小鼠CD68和OX42抗体进行流式鉴定，得到小胶质细胞/巨噬细胞；
[0018]S3、原代培养神经元细胞：
[0019]S3.1、无菌条件下分离出生1
‑
3天的小鼠脑组织并剪碎，加入消化试剂；
[0020]S3.2、在S3.1步骤的脑组织中加入完全培养基终止消化，离心弃上清，沉淀物重悬于完全培养基，静置，去除成纤维细胞，得到第二细胞悬液；
[0021]S3.3、将S3.2步骤所得的第二细胞悬液接种于第二细胞培养瓶，进行第四次培养，随后将培养液全量换成无血清培养基，进行第五次培养，加入阿糖胞苷，进行第六次培养，随后全量换液，进行第七次培养，随后定期半量换液进行第八次培养；
[0022]S3.4、对S3.3步骤所得的细胞进行化学染色，得到神经元细胞；
[0023]S4、神经元细胞与小胶质细胞/巨噬细胞、T细胞共培养：
[0024]S4.1、将5
‑
15ng/mL LPS与S2.4步骤所得的小胶质细胞/巨噬细胞混合，随后与S1.4步骤所得的分选T细胞置于基底胶包被的Transwell小室中进行第一次共培养；
[0025]S4.2、在培养板中加入S3.4步骤得到的神经元细胞，进行第二次共培养。
[0026]优选地，S1.1步骤中的小鼠为雄性野生型C57BL/6J小鼠和雄性TIM1基因敲除小鼠；S2.1步骤中的小鼠为雄性野生型C57BL/6J小鼠和雄性TIM
‑
4基因敲除小鼠；S3.1步骤中的小鼠为雄性野生型C57BL/6J小鼠。
[0027]优选地，S1.1步骤中，用4
‑
6只小鼠的淋巴结或1
‑
3只小鼠的脾脏制备单细胞悬液。
[0028]优选地，S1.2步骤中，一抗为CD4/CD8抗体；孵育温度为2
‑
6℃，时间为25
‑
35min。
[0029]优选地，S1.3步骤中，按每108个细胞加入0.05
‑
0.15mL MACS磁珠，孵育温度为2
‑
6℃，时间为10
‑
20min。
[0030]优选地，S1.2、S1.3、S1.4步骤中，离心条件为2
‑
6℃，1500
‑
2000rpm，10
‑
15min；S2.2和S3.2步骤中，离心的转速为800
‑
1200rpm，时间为4
‑
6min。
[0031]优选地，S1.3步骤中，将细胞通过30
‑
40μm滤网，用0.1
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0.4mL MACS缓冲液冲洗。
[0032]优选地，S2.2和S3.2步骤中，完全培养基为DMEM/F12培养基，静置时间为25
‑
35min。
[0033]优选地，S2.3步骤中，所述第一细胞培养瓶经过多聚L
‑
赖氨酸处理，其培养基为含1％青链霉素、20％胎牛血清的DMEM/F12高糖培养基；所述第本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种神经元细胞与小胶质细胞/巨噬细胞、T细胞共培养体系，其特征在于，所述体系包括神经元细胞、小胶质细胞/巨噬细胞和T细胞；所述神经元细胞、小胶质细胞/巨噬细胞和T细胞来源于基因敲除小鼠和野生型小鼠；所述体系为体外培养体系。2.一种神经元细胞与小胶质细胞/巨噬细胞、T细胞共培养体系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、磁珠分选T细胞：S1.1、无菌条件下分离出生1
‑
3天的小鼠淋巴器官并制备单细胞悬液，去除红细胞，细胞混悬后计数；S1.2、在S1.1步骤所得的细胞悬液中加入一抗孵育，离心并弃上清，沉淀混悬；S1.3、在S1.2步骤所得的细胞悬液中加入MACS磁珠孵育，离心并弃上清，沉淀混悬后进行分离并洗脱；S1.4、将S1.3步骤所得的细胞悬液离心并弃上清，沉淀混悬后计数，即获得带磁珠的分选T细胞；S2、原代培养小胶质细胞/巨噬细胞：S2.1、无菌条件下分离出生1
‑
3天的小鼠脑组织并剪碎，加入消化试剂；S2.2、在S2.1步骤的脑组织中加入完全培养基终止消化，离心弃上清，沉淀物重悬于完全培养基，静置，去除成纤维细胞，得到第一细胞悬液；S2.3、将S2.2步骤所得的第一细胞悬液接种于第一细胞培养瓶，第一次培养后换液，进行第二次培养，分离小胶质细胞/巨噬细胞悬液并进一步纯化小胶质细胞/巨噬细胞，随后进行第三次培养，得到混合细胞；S2.4、对S2.3步骤所得的混合细胞用大鼠抗小鼠CD68和OX42抗体进行流式鉴定，得到小胶质细胞/巨噬细胞；S3、原代培养神经元细胞：S3.1、无菌条件下分离出生1
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3天的小鼠脑组织并剪碎，加入消化试剂；S3.2、在S3.1步骤的脑组织中加入完全培养基终止消化，离心弃上清，沉淀物重悬于完全培养基，静置，去除成纤维细胞，得到第二细胞悬液；S3.3、将S3.2步骤所得的第二细胞悬液接种于第二细胞培养瓶，进行第四次培养，随后将培养液全量换成无血清培养基，进行第五次培养，加入阿糖胞苷，进行第六次培养，随后全量换液，进行第七次培养，随后定期半量换液进行第八次培养；S3.4、对S3.3步骤所得的细胞进行化学染色，得到神经元细胞；S4、神经元细胞与小胶质细胞/巨噬细胞、T细胞共培养：S4.1、将5
‑
15ng/mL LPS与S2.4步骤所得的小胶质细胞/巨噬细胞混合，随后与S1.4步骤所得的分选T细胞置于基底胶包被的Transwell小室中进行第一次共培养；S4.2、在培养板中加入S3.4步骤得到的神经元细胞，进行第二次共培养。3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，S1.1步骤中的小鼠为雄性野生型C57BL/6J小鼠和雄性TIM1基因敲除小鼠；S2.1步骤中的小鼠为雄性野生型C57BL/6J小鼠和雄性TIM
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4基因敲除小鼠；S3.1步骤中的小鼠为雄性野生型C57BL/6J小鼠。4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，S1.1步骤中，用4
‑
6只小鼠的淋巴结或1
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3只小鼠的脾脏制备单细胞悬液。
5.根据权利要求2...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑丽芳，戈全荣，郑红英，
申请(专利权)人：深圳市盐田区人民医院，
类型：发明
国别省市：