一种利用凝乳酶辅助提取山羊乳细胞外囊泡的方法技术

本发明专利技术提供了一种利用凝乳酶辅助提取山羊乳细胞外囊泡的方法，属于生物技术领域。本发明专利技术利用凝乳酶去除山羊乳中的酪蛋白，采取超速离心法提取山羊乳细胞外囊泡粗产物，再加入蔗糖垫进行纯化，获得了高纯度、高质量的山羊乳细胞外囊泡。本发明专利技术还提供了利用上述方法提取的山羊乳细胞外囊泡，促进了对山羊奶细胞外囊泡具体功能的研究和应用。囊泡具体功能的研究和应用。囊泡具体功能的研究和应用。

【技术实现步骤摘要】
一种利用凝乳酶辅助提取山羊乳细胞外囊泡的方法


[0001]本专利技术属于生物
，尤其涉及一种利用凝乳酶辅助提取山羊乳细胞外囊泡的方法。

技术介绍

[0002]细胞外囊泡(Extracellular Vesicles，EV)是由细胞分泌的一种没有复制能力的纳米颗粒，它们存在于各种生物液体中，并已经被证实在细胞间通信中发挥关键作用。
[0003]细胞外囊泡在不同细胞类型之间起着交换运输蛋白质、脂质、miRNA或DNA的作用，目前已经被证明在肿瘤转移、组织再生等过程中发挥重要作用，并已被提出作为不同疾病的预后标志物。例如近年来研究较为广泛的间充质干细胞(MSC)来源的EV具有与MSC相似的生物学效应，如减少细胞凋亡、减轻炎症反应、促进血管生成、抑制纤维化、提高组织修复潜力等，而且易提取、改造，与干细胞移植相比致肿瘤风险低，在损伤修复的生物学治疗中具有广阔应用前景。目前各种细胞培养液上清等来源的细胞外囊泡较难获得且提取后浓度较低，难以大批量生产使用，由于EV的体积非常小，对其分离、观察和鉴定具有一定的挑战性，寻找高效的EV分离和鉴定方法是研究的前提。
[0004]在可能的来源中，乳汁无毒无害且易于获得，可以从中获得高产量、无害和成本效益的细胞外囊泡，因此探究从乳中提取高质量的细胞外囊泡方法具有重大意义。目前针对人乳、牛乳、猪乳、骆驼乳中细胞外囊泡的研究较为广泛，其无毒性和非免疫原性在健康模型中已被证实，且有研究证明可以作为预防药物载体的广泛应用。而针对山羊奶细胞外囊泡的相关研究还较为缺乏，对于山羊奶细胞外囊泡的具体功能也尚未见报道。
[0005]目前提取乳细胞外囊泡的方法运用较多的为超速离心法，但是提取得到的细胞外囊泡纯度不高，效果不好。在不需要使用超高速离心机的方法中使用较多的则是密度梯度离心法和试剂盒提取法，密度梯度离心操作复杂、耗时长且提取纯度较低，另外试剂盒提取法由于提取效率较低且价格昂贵，导致在行业内的认可程度也不高。特别是在乳源细胞外囊泡的相关研究中，如何稳定的得到高浓度高纯度的细胞外囊泡是一个有待解决的重要问题。因此开发一种提取高质量山羊乳细胞外囊泡的方法具有重要意义。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种利用凝乳酶辅助提取山羊乳细胞外囊泡的方法，能够减少提取的细胞外囊泡中的乳蛋白，同时能够保护细胞外囊泡的完整性以及细胞外囊泡中生物大分子的活性。
[0007]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：
[0008]本专利技术提供了一种利用凝乳酶辅助提取山羊乳细胞外囊泡的方法，所述方法包括以下步骤：
[0009]取乳样上清A，加入凝乳酶后，按照2000
‑
3000g的转速离心收集上清B；
[0010]将所述上清B于4℃，按照80000
‑
120000g的转速离心30
‑
40min，收集上清C，使用微
滤膜过滤，收集滤液D；
[0011]将所述滤液D于4℃，按照80000
‑
120000g的转速离心60
‑
80min，收集沉淀F即为细胞外囊泡粗产物；
[0012]将所述细胞外囊泡粗产物重悬，获得的细胞外囊泡重悬样本加到蔗糖垫上，于4℃，按照80000
‑
120000g的转速离心60
‑
80min；
[0013]取出所述蔗糖垫，稀释后，于4℃，按照80000
‑
120000g的转速离心60
‑
80min，去除上清，所得沉淀即为山羊乳细胞外囊泡。
[0014]可选的，所述凝乳酶的使用浓度为0.03
‑
0.05mg/mL，添加量为1.75mg/50mL乳液上清。
[0015]可选的，所述步骤还包括，将所述滤液D于4℃，按照80000
‑
120000g的转速离心60
‑
80min，收集沉淀E；将所述沉淀E重悬后，于4℃，按照80000
‑
120000g的转速离心60
‑
80min，收集沉淀F为细胞外囊泡粗产物。
[0016]可选的，所述蔗糖垫浓度为30％。
[0017]可选的，所述细胞外囊泡重悬样本与蔗糖垫的体积比为2:1
‑
5:1。
[0018]可选的，所述山羊乳细胞外囊泡直接置于
‑
80℃保存，或稀释后于
‑
80℃保存。
[0019]可选的，所述乳样上清A的获得方法包括如下步骤：取乳样，于4℃，按照3000
‑
5000g的转速离心10min，收集上清即为乳样上清A。
[0020]可选的，所述乳样为山羊乳，所述山羊乳为新鲜乳液，或冻存于
‑
80℃，使用时于37℃下解冻后的乳液。
[0021]可选的，所述使用微滤膜过滤为使用0.45μm滤膜过滤。
[0022]本专利技术的另一目的是提供一种采用上述方法获得的山羊乳细胞外囊泡。
[0023]相对于现有技术，本专利技术具有如下有益效果：
[0024]本专利技术提供了一种利用凝乳酶辅助提取山羊乳细胞外囊泡的方法，在对山羊乳进行超高速离心之前添加了凝乳酶预处理的步骤，可以在超高速离心之前使酪蛋白沉降，提前去除乳中的酪蛋白，增强后续离心、过滤等步骤的效率，防止提取出的细胞外囊泡中混入过多的乳蛋白。
[0025]本专利技术用凝乳酶去除山羊乳中的酪蛋白后再进行多次的超速离心，超速离心分离可以准确地重复获取细胞外囊泡，同时最大限度减少蛋白质聚集体和其他膜粒子的共纯化，全程在4℃低温下操作也最大程度的保护了细胞外囊泡中各种生物大分子的活性。
[0026]本专利技术在得到山羊乳细胞外囊泡粗产物后又加入了蔗糖垫纯化步骤，不仅可以去除高密度蛋白质污染物，还能最大程度的保证细胞外囊泡的完整性。
附图说明
[0027]图1：500nm和100nm下凝乳酶辅助法提取山羊乳细胞外囊泡电镜图，其中，A为500nm倍数，B为100nm倍数；
[0028]图2：500nm和100nm下超速离心法提取山羊乳细胞外囊泡电镜图，其中，A为500nm倍数，B为100nm倍数；
[0029]图3：凝乳酶辅助法提取山羊乳细胞外囊泡粒径分布图；
[0030]图4：超速离心法提取山羊乳细胞外囊泡粒径分布图；
[0031]图5：凝乳酶辅助法提取山羊乳细胞外囊泡蛋白标准曲线；
[0032]图6：超速离心法提取山羊乳细胞外囊泡蛋白标准曲线；
[0033]图7：不同方法提取山羊乳细胞外囊泡WB蛋白鉴定图，其中，1为超速离心法提取细胞外囊泡，2为凝乳酶辅助法提取细胞外囊泡。
具体实施方式
[0034]本专利技术提供了一种利用凝乳酶辅助提取山羊乳细胞外囊泡的方法，利用凝乳酶沉降山羊乳中的酪蛋白，结合超速离心法提取山羊奶乳细胞外囊泡，再通过蔗糖垫进行本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用凝乳酶辅助提取山羊乳细胞外囊泡的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：取乳样上清A，加入凝乳酶后，按照2000
‑
3000g的转速离心收集上清B；将所述上清B于4℃，按照80000
‑
120000g的转速离心30
‑
40min，收集上清C，使用微滤膜过滤，收集滤液D；将所述滤液D于4℃，按照80000
‑
120000g的转速离心60
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80min，收集沉淀F即为细胞外囊泡粗产物；将所述细胞外囊泡粗产物重悬，获得的细胞外囊泡重悬样本加到蔗糖垫上，于4℃，按照80000
‑
120000g的转速离心60
‑
80min；取出所述蔗糖垫，稀释后，于4℃，按照80000
‑
120000g的转速离心60
‑
80min，去除上清，所得沉淀即为山羊乳细胞外囊泡。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述凝乳酶的使用浓度为0.03
‑
0.05mg/mL，添加量为1.75mg/50mL乳液上清。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤还包括，将所述滤液D于4℃，按照80000
‑
120000...

【专利技术属性】
技术研发人员：安小鹏，宋宇轩，张磊，江悦，朱俊儒，李广，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：