一种线虫试剂盒及其使用方法技术

本发明专利技术涉及一种线虫试剂盒及其使用方法，该试剂盒包括：96孔板、试剂A和试剂B；96孔板中的每个孔含有LB

【技术实现步骤摘要】
一种线虫试剂盒及其使用方法


[0001]本专利技术涉及生物检测
，具体涉及一种线虫试剂盒及其使用方法。

技术介绍

[0002]随着人民生活质量的提高以及科技的发展，人们对寿命有着更大的期许。因此，从动植物中寻找天然活性成分延缓衰老成为当前的研究热点。构建衰老动物模型，使实验动物呈现与人类相似的衰老表型，是研究人类衰老机制和研发抗衰老活性成分的重要手段。
[0003]目前广泛应用的衰老动物模型，涵盖无脊椎动物、鱼类、啮齿动物和非人灵长类等。其中，秀丽隐杆线虫作为研究衰老的关键模式生物，有着得天独厚的优势：一、培养时间短、繁殖迅速，平均生命周期为2
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3周，为实验研究节约大量时间；二、作为一种真核生物，与高等的生物体有一些相同或相似的细胞和分子结构以及细胞信号控制通路，且基因测序已全部完成，基因组完整，从中所获得的生物学信息或可推广应用至更加复杂的生物体(包括人类)；三、线虫结构简单，通体透明，观察方便，譬如采用普通的光学显微镜即可完成对其头部摆动、身体弯曲频率等运动行为。因此，随着对秀丽隐杆线虫衰老机制研究的不断深入，越来越多的研究者利用线虫作为模式生物进行抗衰老化合物的筛选和氧化应激性研究。
[0004]相关技术中的线虫试剂盒仍需使用者进行挑虫等步骤，工作量大、操作费时；且其试剂盒所提供的线虫材料必须立即使用，保质期极其短暂，无法进行工业化生产和运输。

技术实现思路

[0005]本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
[0006]为此，根据本专利技术的实施例，本专利技术在一方面提出了一种线虫试剂盒，其包括：96孔板、试剂A和试剂B；
[0007]所述96孔板中的每个孔含有LB
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胆固醇培养基和秀丽隐杆线虫幼虫；所述秀丽隐杆线虫幼虫为经同步化后饥饿状态的dauer期线虫；
[0008]所述试剂A为大肠杆菌OP50；
[0009]所述试剂B为5
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氟脲嘧啶。
[0010]根据本专利技术实施例的一种线虫试剂盒，利用秀丽隐杆线虫在环境不佳(处于族群拥挤或食物不足)时，将进入另一种幼虫期，即dauer期，dauer时期的线虫处于一个较为恒定的状态，维持时间超过3个月，且这一时期的持续时间并不会影响发育后的虫体寿命，当提供食物后一个小时内，dauer幼虫即可摆脱饥饿期，二到三个小时后恢复进食，并在十个小时后进入L4幼虫期，经最后一次蜕皮进入成虫期；秀丽隐杆线虫的dauer期可为试剂盒的长时间存储和即开即用提供前提条件，使研究者摆脱线虫购买、培养等繁琐过程，实现时间、金钱的双重减负，可工业化生产，适合在筛选抗衰老药物的领域大规模推广。
[0011]另外，根据本专利技术上述实施例提出的一种线虫试剂盒，还可以具有如下附加的技术特征：
[0012]可选地，经同步化后饥饿状态的dauer期线虫的制备包括以下步骤：
[0013]使用M9缓冲溶液将正处于产卵期的雌雄同体的秀丽隐杆线虫从NGM培养基平板上多次冲洗下至50mL离心管中，静止数分钟，待线虫下沉至管底，弃去上清；
[0014]将线虫液定容至30mL于50mL离心管内，按照线虫液和裂解液2：1的比例，向管中加入裂解液15mL，上下颠倒混合，反应5min后，9000rpm离心3min，弃去上清，收集沉淀；
[0015]沉淀使用M9缓冲液进行上下混匀，以9000rpm离心3min，重复3次，获得含有虫卵的溶液；
[0016]将含有虫卵的溶液于25℃的生化培养箱内培养12h，再将培养后的沉淀转到新的培养基平板中培养，不需要添加大肠杆菌OP50，20℃培养12h孵化幼虫L1期；
[0017]虫卵孵化后不再提供食物，3～4天后线虫进入到饥饿状态，即dauer期线虫幼虫。
[0018]进一步地，将dauer期线虫幼虫吸取至离心管中，使用无菌水进行稀释至线虫悬液的浓度为3500～4000条/mL，再取线虫悬液至96孔板的各孔中，使得每个孔具有70～80条线虫。
[0019]根据本专利技术的实施例，本专利技术在第二方面提出了一种上述线虫试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
[0020](1)将待测药物溶解于试剂A中，作为食物喂养96孔板中的秀丽隐杆线虫幼虫，空白组使用等量无菌水替换待测药物；
[0021](2)秀丽隐杆线虫幼虫从同期化长成L4期计为0d，96孔板在25℃培养箱内恒温培养，每日用体显微镜观察，并记录秀丽隐杆线线虫存活、死亡的数目；
[0022](3)以10天为一个周期补加4μL浓度为12.5mg/mL的试剂B，不定期补充菌液和无菌水至寿命周期结束；
[0023](4)当用体显微镜观察到身体僵直，不动弹的线虫时，线虫被记为死亡；爬到培养皿边缘或皿盖干死、钻到琼脂里面的秀丽隐杆线虫从实验中排除；
[0024](5)采用相关软件对实验数据进行处理、分析，计算出秀丽隐杆线虫的平均寿命，平均寿命显著高于空白组则证明待测药物具有抗衰老活性，平均寿命低于或等于空白组则证明待测药物不具有抗衰老活性。
[0025]根据本专利技术实施例的线虫试剂盒的使用方法，使用该试剂盒能够快速准确地检测线虫寿命，操作简便，适合在筛选抗衰老药物的领域大规模推广。
[0026]本专利技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本专利技术的实践了解到。
附图说明
[0027]图1为根据本专利技术实施例中处于dauer期的秀丽隐杆线虫；
[0028]图2为根据本专利技术实施例中解除饥饿期的秀丽隐杆线；
[0029]图3为根据本专利技术实施例中处于成虫的秀丽隐杆线；
[0030]图4为根据本专利技术实施例的没食子酸对线虫寿命的影响；
[0031]图5为根据本专利技术实施例的芥子酸对线虫寿命的影响；
[0032]图6为根据本专利技术实施例的原花青素对线虫寿命的影响。
具体实施方式
[0033]以下通过特定的具体实例说明本专利技术的技术方案。应理解，本专利技术提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本专利技术可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更
技术实现思路
的情况下，当亦视为本专利技术可实施的范畴。
[0034]为了更好的理解上述技术方案，下面更详细地描述本专利技术的示例性实施例。虽然显示了本专利技术的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本专利技术而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本专利技术，并且能够将本专利技术的范围完整的传达给本领域的技术人员。
[0035]本专利技术采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
[0036]实验材料：
[0037]野生型秀丽隐杆线本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种线虫试剂盒，其特征在于，包括：96孔板、试剂A和试剂B；所述96孔板中的每个孔含有LB
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胆固醇培养基和秀丽隐杆线虫幼虫；所述秀丽隐杆线虫幼虫为经同步化后饥饿状态的dauer期线虫；所述试剂A为大肠杆菌OP50；所述试剂B为5
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氟脲嘧啶。2.如权利要求1所述的线虫试剂盒，其特征在于，经同步化后饥饿状态的dauer期线虫的制备包括以下步骤：使用M9缓冲溶液将正处于产卵期的雌雄同体的秀丽隐杆线虫从NGM培养基平板上多次冲洗下至50mL离心管中，静止数分钟，待线虫下沉至管底，弃去上清；将线虫液定容至30mL于50mL离心管内，按照线虫液和裂解液2：1的比例，向管中加入裂解液15mL，上下颠倒混合，反应5min后，9000rpm离心3min，弃去上清，收集沉淀；沉淀使用M9缓冲液进行上下混匀，以9000rpm离心3min，重复3次，获得含有虫卵的溶液；将含有虫卵的溶液于25℃的生化培养箱内培养12h，再将培养后的沉淀转到新的培养基平板中培养，不需要添加大肠杆菌OP50，20℃培养12h孵化幼虫L1期；虫卵孵化后不再提供食物，3～4天后线虫进入到饥饿状态，...

【专利技术属性】
技术研发人员：张铃玉，黄逸滢，李健，吴达仁，
申请(专利权)人：集美大学，
类型：发明
国别省市：