用于生产异丁烯的方法和组合物技术

公开了包含第一大肠杆菌同源区和第二大肠杆菌同源区的核酸序列，其中所述第一大肠杆菌同源区包含原间隔子相邻基序(PAM)突变；组成型启动子；甲羟戊酸

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于生产异丁烯的方法和组合物
[0001]相关申请交叉引用
[0002]本申请要求2020年5月15日提交的美国临时专利申请号63/010,409的权益，该申请以引用的方式整体并入本文。

技术介绍

[0003]异丁烯是许多化学品和产品的关键前体。例如，异丁烯被用于生产丁基橡胶、对苯二甲酸和汽油性能添加剂(烷基化物)。烷基化物增加辛烷，改善燃烧，减少排放并防止发动机爆震。不幸的是，这些烯烃的生产需要由石油源进行的高能反应(蒸汽裂化)。需要生产有工业意义的烃的更高效反应。
[0004]异丁烯的生物生产已为人所知多年。多种真核生物、古细菌、细菌、真菌和植物天然地通过若干鉴别的路径生产低浓度的这些化合物。鉴于生产方面的重大进步，微生物过程可产生能用于工业应用的异丁烯。此外，使用微生物允许降低对石油源的依赖性，因为可以使用多种多样的原料，例如玉米秆、废水或粪肥。
[0005]产生异丁烯的一个特定微生物路径是甲羟戊酸(MVA)路径。MVA路径是用于产生异戊烯焦磷酸的主要途径，异戊烯焦磷酸是一大类生物代谢物的关键结构单元。这一路径中的最后一个酶是甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(MVD)并且MVD具有脱去3
‑
羟基异戊酸(3
‑
HIV)的羧基得到异丁烯的能力(反应1)。已鉴别出灼热嗜酸古菌(Picrophilus torridus)(来自酸性环境的古细菌)的MVA路径中的酶是甲羟戊酸
‑3‑
激酶(M3K)。这种酶通过催化3
‑
HIV磷酸化成不稳定的3
‑r/>磷酸中间体，该中间体经历自发脱羧基形成异丁烯(反应2)而具有最高的异丁烯形成速率。
[0006]C5H9O3+ATP
→
C4H8+CO2+P
i
ꢀꢀꢀ
(反应1)
[0007]C5H9O3+ATP
→
C5H8O3P
→
C4H8+CO2+P
i
ꢀꢀꢀ
(反应2)
[0008]使用基于质粒的系统将MVD和M3K基因独立地工程改造至大肠杆菌中。当在大肠杆菌中表达M3K时，在合成培养基中，异丁烯生产速率达到高达507pmol min
‑1g细胞
‑1。
[0009]尽管在生物工程方面取得了进展，但异丁烯的生物生产仍有限。这部分是因为需要抗生素(基于质粒)来维持或控制表达的低效表达系统受到限制。生物生产有限的另一个原因是因为未知的竞争性代谢路径。微生物代谢可被描述为一个复杂的网络，其中一个反应的产物可穿梭于若干不同的竞争反应。对于高效生物生产，需要将竞争反应减到最少。
[0010]为了克服这些障碍，本公开描述了将有关异丁烯的两种生物合成基因(M3K和MVD)插入大肠杆菌染色体中。此外，还可以通过将所述基因放于16S rRNA基因启动子的控制下并通过将所述基因放入已知具有较高表达水平的基因组的一部分中来增加表达水平。将所述基因放入染色体中还消除了对于使用抗生素将基因维持在质粒中的需求。此外，这些基因可以与原生路径一起作用以由如葡萄糖之类简单有机糖或如粪肥之类复杂碳产生异丁烯。本文所描述的异丁烯生产水平已被增加至304μmol L
‑1hr
‑1。

技术实现思路

[0011]公开了包含第一大肠杆菌同源区和第二大肠杆菌同源区的核酸序列，其中所述第一大肠杆菌同源区包含原间隔子相邻基序(PAM)突变；组成型启动子；甲羟戊酸
‑3‑
激酶(M3K)基因；甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(MVD)基因。
[0012]公开了包含一个或多个所公开的核酸序列的载体。
[0013]公开了包含核酸序列的重组细胞，其中所述核酸序列包含第一大肠杆菌同源区和第二大肠杆菌同源区，其中所述第一大肠杆菌同源区包含PAM突变；组成型启动子；M3K基因；MVD基因。
[0014]公开了制备重组细胞的方法，所述方法包含将所公开的线性核酸序列中的任一者施用至细胞，其中所述细胞将线性核酸序列并入细胞基因组中。在一些方面，重组细胞是细菌细胞。
[0015]公开了生产异丁烯的方法，所述方法包含在适于细菌生长以及M3K和MVD表达的条件下，培养所公开的重组细菌细胞中的任一种，所述核酸序列包含组成型启动子；M3K基因和MVD基因，其中所述MVD脱去3
‑
羟基异戊酸(3
‑
HIV)的羧基得到异丁烯，并且其中所述M3K催化3
‑
HIV磷酸化成不稳定3
‑
磷酸中间体，所述中间体经历自发脱羧基得到异丁烯。
[0016]所公开的方法和组合物的另外优势将部分地在以下描述中阐述，并且将部分地从描述中理解，或者可通过实践所公开的方法和组合物来学习。借助于所附权利要求中特别指出的元素和组合，将实现且获得所公开的方法和组合物的优点。应理解，前述一般描述和下述详细描述两者均仅为示例性和说明性的，并不是所要求保护的本专利技术的限制。
附图说明
[0017]并入本说明书中且构成本说明书的部分的附图示出了所公开的方法和组合物的若干实施例，并且连同说明书一起，作用于解释所公开的方法和组合物的原理。
[0018]图1显示了用于生产工业石化异丁烯的MVA路径衍生物的图。
[0019]图2是包含插入大肠杆菌基因组中的M3K和MVD的核酸序列的示意图。
[0020]图3显示了溶剂诱导的失调。在溶剂暴露之后失调基因的总数(黑色条形)和相对数量(红色和蓝色条形)。所有数据是明显失调的基因，其中当与无溶剂对照相比较时，Bon Ferroni校正的p值<0.05。
[0021]图4显示溶剂暴露聚类。有关溶剂暴露对基因表达的影响的主成分分析。各成分描述了在由DESeq
‑
2生成的似然估计内基因表达的变化。聚类较紧密的样本显示出比较类似的基因失调反应。处理组一和二独立地以包围处理组的椭圆形为界进行聚类。
[0022]图5显示了针对溶剂暴露的保守反应。在暴露于丙酮、异丁醇和异丁烯之后经历表达变化的应激反应基因的Log2倍数变化。在所有处理组中伴侣蛋白clp和ibp基因家族上调。酸应激反应adi和gad基因家族的混合表达。P
adj
<0.05
○
。误差条是
±
log倍数变化标准误差(LFCSE)。
[0023]图6显示了针对烃暴露的保守反应。在暴露于有机溶剂之后经历表达变化的应激反应基因的Log2倍数变化。所有处理组的保守反应是：伴侣蛋白clp和ibp基因家族上调以及酸应激反应adi和gad基因家族下调。P
adj
<0.05
○
。误差条是
±
LFCSE。
[0024]图7显示太空飞行对基因表达的影响。太空飞行诱导的差异性表达的基因计数，比
较了地面与ISS样本的相等时间点来筛选太空飞行诱导的作用。黑色条本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种核酸序列，所述核酸序列包含：a.第一大肠杆菌同源区，其中所述第一大肠杆菌同源区包含PAM突变；b.组成型启动子；c.甲羟戊酸
‑3‑
激酶(M3K)基因，所述基因包含与SEQ ID NO:1的序列具有至少90％同一性的序列；d.甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(MVD)基因，所述基因包含与SEQ ID NO:2的序列具有至少90％同一性的序列；以及e.第二大肠杆菌同源区。2.根据权利要求1所述的核酸序列，其中所述组成型启动子是16SrRNA启动子。3.根据权利要求1所述的核酸序列，其中所述组成型启动子是T7A1启动子。4.根据权利要求1至3中任一项所述的核酸序列，其中所述第一大肠杆菌同源区和所述第二大肠杆菌同源区与大肠杆菌菌株MG1655同源。5.根据权利要求1至4中任一项所述的核酸序列，其中所述PAM突变是CAAA。6.根据权利要求1至5中任一项所述的核酸序列，其中所述MVD基因和所述M3K基因是可操作地连接的。7.根据权利要求1至6中任一项所述的核酸序列，其中所述核酸序列是线性的。8.根据权利要求1至7中任一项所述的核酸序列，其中所述M3K基因包含SEQ ID NO:1的序列。9.根据权利要求1至8中任一项所述的核酸序列，其中所述MVD基因包含SEQ ID NO:2的序列。10.一种载体，所述载体包含根据权利要求1至9中任一项所述的核酸序列。11.根据权利要求10所述的载体，其中所述载体是病毒载体。12.根据权利要求10所述的载体，其中所述载体是质粒。13.一种重组细胞，所述重组细胞包含核酸序列，其中所述核酸序列包含：a.第一大肠杆菌同源区，其中所述第一大肠杆菌同源区包含PAM突变；b.组成型启动子；c.甲羟戊酸
‑3‑
激酶(M3K)基因，所述基因包含与SEQ ID NO:1的序列具有至少90％同一性的序列；d.甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(MVD)基因，所述基因包含与SEQ ID NO:2的序列具有至少90％同一性的序列；以及e.第二大肠杆菌同源区。14.根据权利要求13所述的重组细胞，其中所述核酸序列被整合至所述重组细胞的基因组中。15.根据权利要求13至14中任一项所述的重组细胞，其中所述重组细胞是细菌细胞。16.根据权利要求15所述的重组细胞，其中所述细菌细胞是大肠杆菌。17.根据权利要求14至16中任一项所述的重组细胞，其中...

【专利技术属性】
技术研发人员：B，
申请(专利权)人：阿拉斯加大学安克雷奇分校，
类型：发明
国别省市：