一种磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶突变体及其应用。所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶突变体为磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的氨基酸序列中经过多种突变得到。本发明专利技术提供了一种磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的多个突变位点，并进一步发现菌株中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的这些位点经过突变后，其表达谷氨酸、谷氨酰胺和脯氨酸等氨基酸的产量显著提高，这在提高菌株生产谷氨酸及其衍生物的领域具有重要意义。领域具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶突变体及其应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及一种磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶突变体及其应用。

技术介绍

[0002]三羧酸循环是需氧生物体内普遍存在的代谢途径，其中的某些中间产物是合成生物体中重要有机物的前提，例如草酰乙酸(OAA)是天冬氨酸族氨基酸合成的碳架，α
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酮戊二酸是谷氨酸族氨基酸合成的碳架，当三羧酸循环的中间产物用于合成有机物的合成时，生物体会启动回补途径以确保三羧酸循环可以正常运行。
[0003]谷氨酸棒杆菌有两条回补途径，分别是磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC，ppc编码)催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)生成草酰乙酸(OAA)，以及丙酮酸羧化酶(PC，pyc编码)催化丙酮酸生成草酰乙酸。这两种回补途径对于菌株的氨基酸代谢具有重要的影响。

技术实现思路

[0004]为了解决现有技术存在的问题，本专利技术提供一种磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶突变体及其应用。
[0005]第一方面，本专利技术提供一种磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶突变体，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶突变体为磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的氨基酸序列中经过如下任意一种或多种突变得到：
[0006]第27位由谷氨酸突变为天冬氨酸、第34位由谷氨酰胺突变为精氨酸、第85位由酪氨酸突变为组氨酸、第180位由异亮氨酸突变为亮氨酸、第303位由赖氨酸突变为谷氨酸、第360位由苏氨酸突变为丙氨酸、第408位由丙氨酸突变为丝氨酸、第542位由谷氨酰胺突变为精氨酸、第634位由精氨酸突变为赖氨酸、第840位由精氨酸突变为组氨酸。
[0007]进一步地，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.1所示的序列(由SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列编码得到)。
[0008]进一步地，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，由如SEQ ID NO.4所示核苷酸编码得到。本专利技术进一步用于编码所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶突变体的核酸。
[0009]第二方面，本专利技术提供一种重组微生物，所述重组微生物中，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的氨基酸序列发生如下突变中的任意一种或多种：
[0010]第27位由谷氨酸突变为天冬氨酸、第34位由谷氨酰胺突变为精氨酸、第85位由酪氨酸突变为组氨酸、第180位由异亮氨酸突变为亮氨酸、第303位由赖氨酸突变为谷氨酸、第360位由苏氨酸突变为丙氨酸、第408位由丙氨酸突变为丝氨酸、第542位由谷氨酰胺突变为精氨酸、第634位由精氨酸突变为赖氨酸、第840位由精氨酸突变为组氨酸。
[0011]进一步地，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶突变体的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.1所示的序列。
[0012]进一步地，所述微生物为谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌或黄色短杆菌。
[0013]本专利技术优选实施例中使用的出发菌株MHZ
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0112
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8为谷氨酸产生菌，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11941，公开于中国专利CN202011285971.7。
[0014]出发菌株MHZ
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0513
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3为谷氨酰胺产生菌，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13405，公开于中国专利CN201611250325.0。
[0015]出发菌株MHZ
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0701为脯氨酸产生菌，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13757，公开于中国专利CN201710385500.5。
[0016]本专利技术进一步提供所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶突变体或所述核酸在提高菌株氨基酸产量中的应用。
[0017]进一步地，所述菌株为谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌或黄色短杆菌；和/或，
[0018]所述氨基酸为谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、鸟氨酸、精氨酸、瓜氨酸或羟脯氨酸中的一种或多种。
[0019]本专利技术进一步提供所述重组微生物在生产氨基酸中的应用；优选为在生产谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、鸟氨酸、精氨酸、瓜氨酸或羟脯氨酸中的一种或多种中的应用。
[0020]本专利技术的有益效果如下：
[0021]本专利技术提供了一种磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶突变体，包括多个位点的突变，将该突变体应用于菌株中时，发现在这些位点发生突变时，其谷氨酸、谷氨酰胺和脯氨酸的产量显著提高。
[0022]具体地，菌株MHZ
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0112
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8/pXMJ19
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ppc10与MHZ
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0112
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8/pXMJ19
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ppc相比，谷氨酸产量从35.8g/L提高到39.9g/L，产酸提高11.5％；将质粒pXMJ19
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ppc10和pXMJ19
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ppc转化到谷氨酸棒杆菌MHZ
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0513
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3，菌株MHZ
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0513
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3/pXMJ19
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ppc10与MHZ
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0513
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3/pXMJ19
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ppc相比，谷氨酰胺产量从28.8g/L提高到32.3g/L，产酸提高12.2％；将质粒pXM J19
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ppc10和pXMJ19
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ppc转化到谷氨酸棒杆菌MHZ
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0701，菌株MHZ
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0701/pXMJ19
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ppc10与MHZ
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0701/pXMJ19
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ppc相比，脯氨酸产量从38.3g/L提高到40.6g/L，产酸提高6％。由此可见ppc10中点突变E27D、Q34R、Y85H、I180L、K303E、T360A、A408S、Q542R、R634K、R840H有利于谷氨酸的生产。
[0023]本专利技术提供的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶突变体不仅能促进谷氨酸生产，还能促进谷氨酸衍生物谷氨酰胺、脯氨酸的生产，显而易见，可将该突变应用于其他谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌等宿主菌中，用于生产谷氨酸其他衍生物，例如鸟氨酸、精氨酸、瓜氨酸、羟脯氨酸等。
具体实施方式
[0024]以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。
[0025]实施例中涉及的引物名称及序列如表1(SEQ ID NO.5
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8)所示。
[0026]表1引物序列
[0027]引物序列(由上至下依次为)P1TGTGAGCGGATAACAATTTCAP2TTCTGATTTAATCTGTATCAGGCTGA
ppc
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FTCCCcccgggATGACTGATTTTTTACGCGATGACATCAppc
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶突变体，其特征在于，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶突变体为磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的氨基酸序列中经过如下任意一种或多种突变得到：第27位由谷氨酸突变为天冬氨酸、第34位由谷氨酰胺突变为精氨酸、第85位由酪氨酸突变为组氨酸、第180位由异亮氨酸突变为亮氨酸、第303位由赖氨酸突变为谷氨酸、第360位由苏氨酸突变为丙氨酸、第408位由丙氨酸突变为丝氨酸、第542位由谷氨酰胺突变为精氨酸、第634位由精氨酸突变为赖氨酸、第840位由精氨酸突变为组氨酸。2.根据权利要求1所述的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶突变体，其特征在于，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.1所示的序列。3.一种核酸，其特征在于，所述核酸用于编码权利要求1或2所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶突变体。4.一种重组微生物，其特征在于，所述重组微生物包中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的氨基酸序列发生如下突变中的任意一种或多种：第27位由谷氨酸突变为天冬氨酸、第34位由谷氨酰胺突变为精氨酸、第85位由酪氨酸突变为组氨酸、第180位由异亮氨酸突变为亮...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴涛，栾明月，张晓云，常志帅，赵津津，李岩，
申请(专利权)人：梅花上海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：