一种微载体及其制备方法，应用技术

本申请涉及生物医药领域，具体公开了一种微载体及其制备方法，应用。所述微载体包括微载体核及包裹在所述微载体核上的表面修饰物；其中所述微载体核包括海藻酸钠，阿魏酸和氯化钙，所得微载体具有透明和可降解的特性，且能够提高细胞扩增的倍数。所述微载体的制备包括微载体核的制备和表面修饰两个步骤，制备方法较为简单，易于控制；将本申请所得微载体用于悬浮培养间充质干细胞，能够实时对细胞的生长状态进行观察，并可以进行相应的调整，培养6天后，细胞的扩增倍数在5.53倍以上。细胞的扩增倍数在5.53倍以上。

【技术实现步骤摘要】
一种微载体及其制备方法，应用


[0001]本申请涉及生物
，更具体涉及一种微载体及其制备方法，应用。

技术介绍

[0002]干细胞的分离和大规模培养是干细胞研究及临床应用的前提和基础。然而，通过体外分离获得的干细胞数量十分有限，远不能达到科研和临床的实际需求。另外，在传统的干细胞单层培养中，随着传代次数的增加或培养时间的延长，干细胞逐渐失去自我更新能力、多向分化潜能逐渐减弱和克隆形成率逐渐降低。
[0003]近些年，微载体培养技术是一种新兴的大规模细胞培养技术，广泛地应用于组织工程中种子细胞的扩增。细胞微载体培养技术的出现并逐渐成熟，既能保证细胞基质的均一性，又能实现细胞在短时间内高密度生长，成为了目前细胞培养的主流技术。
[0004]在微载体培养技术中，微载体是其中重要的组成部分。微载体具有比表面积大等优点，在微载体培养技术中起到决定性作用。但是，现有的微载体并不具备透明的特性，这为进一步观察细胞带来了很多挑战，只能通过荧光染色的方式进行观察细胞，不利于实时观察细胞的生长状态。因此，需要一种具有透明性质的微载体，能够实时对细胞的培养过程进行观察及监测，便于对细胞的培养条件进行及时调整。

技术实现思路

[0005]为了实时观察细胞的生长状态，本申请提供了一种微载体及其制备方法，应用。
[0006]第一方面，本申请提供了一种微载体，包括微载体核及包裹在所述微载体核上的表面修饰物；所述微载体核包括海藻酸钠，阿魏酸和氯化钙。
[0007]在本申请中，海藻酸钠，阿魏酸和氯化钙的结合可以形成微载体核，微载体核呈小球状，在微载体核的表面上包裹或包被有表面修饰物，表面修饰物能够促进细胞的贴壁生长，提升了细胞的贴壁效率，制得微载体。所得微载体具有透明、可降解等性质，可以实时进行观察细胞的生长状态，从而调节细胞的扩增培育的条件，将本申请所得微载体用于细胞的扩增培养，能够提高细胞的扩增倍数，使得扩增倍数在5.53倍以上。
[0008]在一个实施方案中，所述表面修饰物选自丝素蛋白、明胶或胶原。
[0009]在本申请中，所述表面修饰物选择丝素蛋白、明胶和胶原中的一种，丝素蛋白、明胶和胶原中均含RGD三肽序列(Arg
‑
Gly
‑
Asp)，该序列是细胞的识别位点。因此，表面修饰物的主要作用是提供细胞识别的位点，促进细胞贴壁，提高贴壁率，进而能够提高细胞的扩增倍数。表面修饰物为胶原时，Ⅰ型胶原，优选地，所述表面修饰物为丝素蛋白。
[0010]第二方面，本申请提供了一种微载体的制备方法，包括以下步骤，(1)微载体核的制备：将海藻酸钠溶液和阿魏酸进行混合，制得混合液；将所述混合液滴入氯化钙溶液中，制得微载体核；(2)表面修饰：将所述微载体核置于表面修饰物中，搅拌后，制得微载体。
[0011]在本申请中，首先将海藻酸钠加入去离子水中，配制成海藻酸钠溶液；再将海藻酸钠溶液与阿魏酸进行混合，制得混合液；利用微球制备仪抽取混合液，在静电场的作用下推出混合液，混合液被分散成液滴；液滴滴入持续搅拌的氯化钙溶液中，制得微载体核。最后将微载体核放置于由表面修饰物配制的溶液中，搅拌后，即得微载体。
[0012]在一个实施方案中，所述海藻酸钠溶液的浓度为1
‑
3％，所述阿魏酸的浓度为1
‑
5％，所述氯化钙溶液的浓度为2
‑
6％。
[0013]优先地，所述海藻酸钠溶液的浓度为1
‑
3％，所述阿魏酸的浓度为1
‑
5％，所述氯化钙溶液的浓度为4
‑
6％。
[0014]通过采用上述技术方案，当海藻酸钠溶液的浓度大于3％时，浓度过高，导致微载体密度过大，在悬浮培养时搅拌速度也会过大，导致的细胞剪切力过大，影响细胞的成活率；当海藻酸钠溶液的浓度小于1％时，浓度过低，微载体无法成球状，因此，不能应用于细胞的培育过程中。
[0015]同样地，当阿魏酸的浓度大于5％时，过多的阿魏酸无法完全被清洗掉，在后期细胞培养过程中，影响细胞的生长，降低细胞的成活率；当阿魏酸的浓度小于1％时，降低了交联效果，从而影响细胞贴壁功效，因此，导致在细胞培育过程中，扩增倍数降低。
[0016]同样地，当氯化钙溶液的浓度大于6％时，微载体较脆，将微载体用于细胞培育时容易被破碎，进而影响细胞的培育效率；当氯化钙溶液的浓度小于2％时，微载体成球性不足，难以从液体变成固体小球，因此，在细胞培育时，导致扩增倍数较低。
[0017]在一个实施方案中，所述表面修饰物的浓度为0.1％
‑
2％。
[0018]通过采用上述技术方案，表面修饰物包裹或包被于微载体核的表面上，从而形成微载体，微载体用于细胞的扩增培养中。在制备微载体过程中，当表面修饰物的浓度大于2％时，所得微载体无法有效地从表面修饰物中分离出来，降低了微载体的生产效率；当表面修饰物的浓度小于0.1％时，在细胞扩增培养过程中，细胞无法有效地贴在所得微载体上，也就是说，细胞的贴壁率较低，最终降低了细胞的扩增倍数。
[0019]第三方面，本申请提供了一种微载体在细胞培养中的应用，包括以下步骤，(1)接种细胞：将所述微载体接种细胞，在反应器上扩增培养；(2)微载体裂解：向反应器内加入三聚磷酸钠溶液对所述微载体进行裂解，制得细胞悬液；(3)回收细胞：收集所述细胞悬液中的细胞，进行计数。
[0020]在本申请中，利用海藻酸钠，阿魏酸和氯化钙制得微载体核，微载体核具有可降解、透明等优点，可以实时观察效果的生长状态，在微载体核上包裹有表面修饰物，制得微载体，表面修饰物能够促进细胞进行贴壁生长。
[0021]将所得微载体用于细胞培养中，在微载体上进行接种细胞，然后将接种细胞后的微载体转移到反应器中进行培养；再向反应器中加入三聚磷酸钠溶液，制得细胞悬液，最后进行收集所得细胞悬液中的细胞，进行计数及分析。
[0022]在一个实施方案中，所述三聚磷酸钠溶液的浓度为2
‑
10％。
[0023]优选地，所述三聚磷酸钠溶液的浓度为5
‑
8％。
[0024]更优选地，所述三聚磷酸钠溶液的浓度为5％。
[0025]在反应器中加入三聚磷酸钠溶液，能够对微载体进行降解。本申请中三聚磷酸钠
溶液的浓度可以为2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％。当三聚磷酸钠溶液的浓度大于10％时，高浓度溶液影响细胞活率；当三聚磷酸钠溶液的浓度小于2％，微载体无法被降解。
[0026]目前，利用微载体培养技术进行培养细胞时，培养一段时间后进行收获细胞。采用现有的微载体进行细胞的培养，需要利用酶进行收获，但是，这样收获方式非常容易损伤细胞，直接导致细胞的收获率或扩增倍数的降低。本申请利用三聚磷酸钠溶液能够对由海藻酸钠，阿魏酸和氯化钙制得的微载体进行降解，然后可以进行细胞回收，所以，当微载体降解不充分时，直接影响着细胞的收获率或扩增倍数。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种微载体，其特征在于，包括微载体核及包裹在所述微载体核上的表面修饰物；所述微载体核包括海藻酸钠，阿魏酸和氯化钙。2.根据权利要求1所述微载体，其特征在于，所述表面修饰物选自丝素蛋白、明胶或胶原。3.一种如权利要求1或2所述微载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤，（1）微载体核的制备：将海藻酸钠溶液和阿魏酸进行混合，制得混合液；将所述混合液滴入氯化钙溶液中，制得微载体核；（2）表面修饰：将所述微载体核置于表面修饰物中，搅拌后，制得微载体。4.根据权利要求3所述微载体的制备方法，其特征在于，所述海藻酸钠溶液的浓度为1
‑
3%，所述阿魏酸的浓度为1
‑
5%，所述氯化钙溶液的浓度为2
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6%。5.根据权利要求4所述微载体的制备方法，其特征在于，所述海藻酸钠溶液的浓度为1
‑
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【专利技术属性】
技术研发人员：田猛，曹毓琳，
申请(专利权)人：唐颐控股深圳有限公司，
类型：发明
国别省市：