一种固定化的电化学传感酶元件及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种固定化的电化学传感酶元件及其制备方法和应用。该一种固定化的电化学传感酶元件包括工作电极和附着于所述工作电极表面的壳聚糖和融合蛋白ChiBD

【技术实现步骤摘要】
一种固定化的电化学传感酶元件及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及蛋白质工程改造和电化学传感器
，具体涉及一种电化学传感酶元件的固定化方法及其应用。

技术介绍

[0002]酶元件的固定化是酶生物传感器设计的必要和关键步骤之一。固定化方法可通过影响酶的定向、负荷、迁移率、稳定性、结构和生物活性等影响生物传感器的性能参数（灵敏度、选择性和稳定性）。常用的酶元件的固定化方法包括吸附法、交联法、共价键合法和包埋法等。
[0003]吸附法是通过酶分子极性键、氢键、疏水键的作用，将酶吸附于不溶性载体上。但是由于酶与载体相互作用力弱，存在着易脱落、泄露等的缺点。与功能试剂如碳二亚胺和戊二醛的交联也是常用的固定化方法。然而，这些方法容易引起酶蛋白高级结构变化，破坏部分活性中心，从而引起酶活性损失。共价键合法是酶与载体以共价键结合的固定化方法，将载体活化后与酶有关基团发生偶联反应。键合法的优点是酶与载体结合牢固，不易出现酶泄露的问题，但是该方法操作复杂，反应条件苛刻，甚至底物的专一性等酶的性质也会发生变化。
[0004]包埋法是将酶固定在三维基质中，如电聚合膜、光聚合物、硅胶、多糖或碳浆等两亲性网络，操作简单，反应温和。壳聚糖分子存在丰富的羟基和氨基，与各种蛋白质的亲和力非常高，生物相容性好，为酶提供自然微环境，并可提供足够的可及性使得电子在酶和电极之间穿梭，已广泛用作固定化酶载体。然而由于壳聚糖和酶之间未进行化学反应结合，这种包埋固定具备良好生物相容性的同时也伴随着酶泄露的问题。

技术实现思路
<br/>[0005]针对上述现有技术的问题，本专利技术提供一种固定化的电化学传感酶元件及其制备方法和应用。本专利技术同时利用壳聚糖与蛋白标签的亲和作用和壳聚糖本身的包埋作用固定酶得到电化学酶元件，实现了酶元件的定向、有序固定，且固定化效率高，制得的电化学传感酶元件灵敏度高、使用寿命长。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用如下的技术方案：一种固定化的电化学传感酶元件，包括工作电极和附着于所述工作电极表面的壳聚糖和融合蛋白ChiBD
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LGOX的混合物；所述融合蛋白ChiBD
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LGOX由如下方法制得：（1）通过一步克隆的方法在载体质粒的多克隆位点插入蛋白标签ChiBD
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AB；（2）在蛋白标签后融合目的蛋白基因LGOX；（3）将连接蛋白标签ChiBD
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AB和目的蛋白基因LGOX的质粒导入宿主菌株表达，获得粗酶液；（4）纯化后获得所述融合蛋白ChiBD
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LGOX。
[0007]步骤（1）、（2）、（3）与现有技术CN 109321539A中的相应步骤相同。
[0008]本专利技术还提供上述固定化的电化学传感酶元件的制备方法，包括：将所述融合蛋白ChiBD
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LGOX和壳聚糖的溶液混合均匀后滴涂于所述工作电极表面，干燥后即得。
[0009]优选的，所述壳聚糖的溶液由壳聚糖溶解于1%wt乙酸溶液，用NaOH调节pH至6.0后得到。
[0010]优选的，所述融合蛋白ChiBD
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LGOX和所述壳聚糖的比例为20 nmol :5~15 g。
[0011]本专利技术还提供上述固定化的电化学传感酶元件在生物传感器中的应用。
[0012]优选的，所述工作电极为普鲁士蓝修饰电极。更优选的，所述普鲁士蓝修饰电极由专利CN101532979A的方法制备得到。
[0013]本专利技术与现有技术相比具有以下优点：（1）本专利技术提出的电化学传感酶元件的固定化方法，将酶元件固定于壳聚糖基质中的同时，利用生物亲和标签ChiBD对壳聚糖特异性的位点结合，实现对酶元件的定向、有序固定，进一步提高了固定化效率；（2）本专利技术利用融合蛋白ChiBD
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LGOX所构建的L
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谷氨酸生物传感器，不仅提升使用寿命，由于酶元件的定向固定，同时提高了检测的灵敏度。
附图说明
[0014]图1是本专利技术所用的融合蛋白ChiBD
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LGOX的蛋白结构模拟与分子对接图。
[0015]图2 实施例1中固定化试剂壳聚糖与戊二醛的生物相容性比较图。
[0016]图3 固定化试剂壳聚糖对酶元件LGOX和ChiBD
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LGOX的固定化效率比较图。
[0017]图4 计时电流法检测L
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谷氨酸生物传感器的性能响应图，其中（A）是基于LGOX的L
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谷氨酸生物传感器（B）是基于ChiBD
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LGOX的L
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谷氨酸生物传感器。
[0018]图5 基于LGOX和ChiBD
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LGOX的L
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谷氨酸生物传感器的灵敏度变化图。
[0019]图6是本专利技术固定化的电化学传感酶元件的结构和工作过程示意图。
具体实施方式
[0020]下面结合附图和具体实例对本专利技术进行详细说明，可以帮助更好地理解本专利技术。实施例所描述的内容仅用于说明本专利技术，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本专利技术。
[0021]实施例11. 融合蛋白ChiBD
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LGOX的制备：案子CN 109321539A的方法，通过一步克隆的方法在载体质粒的多克隆位点插入蛋白标签ChiBD
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AB；在蛋白标签后融合目的蛋白基因LGOX；将连接蛋白标签ChiBD
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AB和目的蛋白基因LGOX的质粒导入宿主菌株表达，获得粗酶液；纯化后获得融合蛋白ChiBD
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LGOX。
[0022]2. 固定化的电化学传感酶元件的制备：将壳聚糖溶解于1%乙酸溶液，用NaOH调节pH至6.0，得到1%wt的壳聚糖溶液。
[0023]取20 nmol/L融合蛋白ChiBD
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LGOX与壳聚糖溶液等体积预混，之后滴涂在普鲁士
蓝修饰电极上，自然干燥，得到固定化的电化学传感酶元件。
[0024]3. 利用AlphaFold2对制得的融合蛋白ChiBD
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LGOX的三维结构进行计算机模拟预测，并用于与底物壳聚糖的分子对接。利用AutoDock将ChiBD
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LGOX的结构与底物壳聚糖进行分子对接。使用PyMOL可视化分子结构。如图1所示，ChiBD结合域可以作为生物亲和标签对壳聚糖特异性的位点结合，允许ChiBD
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LGOX定向、有序地固定在壳聚糖上。表明本专利技术的固定化策略可提供更合适和均匀的取向，暴露更多的活性结构域面向电极表面，增强与电解质的界面交换，有助于提升酶电化学传感器性能。
[0025]4. 生物相容性：将纯酶LGOX和ChiBD
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LGOX分别制备得到酶浓度均为20 nmol/L的酶液，之后分别与不同浓度的戊二醛溶液和壳聚糖溶液（0.5%，1.0%，1.5%，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种固定化的电化学传感酶元件，其特征在于，包括工作电极和附着于所述工作电极表面的壳聚糖和融合蛋白ChiBD
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LGOX的混合物；所述融合蛋白ChiBD
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LGOX由如下方法制得：（1）通过一步克隆的方法在载体质粒的多克隆位点插入蛋白标签ChiBD
‑
AB；（2）在蛋白标签后融合目的蛋白基因LGOX；（3）将连接蛋白标签ChiBD
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AB和目的蛋白基因LGOX的质粒导入宿主菌株表达，获得粗酶液；（4）纯化后获得所述融合蛋白ChiBD
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LGOX。2.根据权利要求1所述的固定化的电化学传感酶元件，其特征在于，所述工作电极为普鲁士蓝修饰电极。3. 根据权利要求1所述的固定化的电化学传感酶元件，...

【专利技术属性】
技术研发人员：周杰，杨璐，姜岷，董维亮，陈敏皎，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：