一种荧光发射比率超分辨成像方法技术

本发明专利技术提供了一种荧光发射比率超分辨成像方法，包括脉冲激光器，脉冲激光器发出的激光经过半波片，再经过格兰激光棱镜，经过格兰激光棱镜其中一束激光传向高速光电二极管探测器，另一束激光传向第一分束器，分别照向第一反射镜和螺旋相位板，经过螺旋相位板的激光传向第二反射镜，经过第二反射镜后传向角反射器，经过第一反射镜的激光传向第二分束器，分别传向角反射器和第三反射镜，经过第三反射器的激光依次通过双色镜、振镜、扫描透镜、管镜和四分之一玻片后，通过物镜聚焦后照射至载物台的样品上。本发明专利技术降低超分辨技术对荧光染料和样品制备的要求，拓宽染料的选择范围，为低成本的活体超分辨成像研究提供技术支撑。本的活体超分辨成像研究提供技术支撑。本的活体超分辨成像研究提供技术支撑。

【技术实现步骤摘要】
一种荧光发射比率超分辨成像方法


[0001]本专利技术属于光学显微镜成像方法
，具体涉及一种荧光发射比率超分辨成像方法。

技术介绍

[0002]人类对信息的摄取主要是通过眼睛，但是人类眼睛的敏感性与光的波长息息相关。由于只能识别波长为400～760nm范围内的光波，正常视力的人眼只能在明视距离处25cm分辨出亚毫米级的物体。如果要观察更小的物体，则需要借助于显微镜。光学显微镜的专利技术让人类第一次观察到了由细胞作为基本结构和功能单元的活体生物，如今已广泛的应用于生活和科学研究的各个领域。面向活细胞研究的光学显微成像技术具有非接触、无损伤和特异性的优点，可以对细胞进行原位、实时和动态研究，深入理解细胞器、蛋白质以及分子之间的相互作用和生理过程，极大地推动了生命科学的进步和发展。但是，光学显微镜的分辨率受光学衍射的限制，无法清晰辨别尺寸在200nm以下的生物结构。为了研究和揭示亚细胞结构及相关分子的相互作用和作用规律，迫切需要突破光学衍射极限的成像技术。
[0003]为了解决纳米级分辨率的成像需求，超分辨显微成像技术应运而生。在近三十年的时间里，基于不同原理的超分辨成像方法被陆续提出，使光学显微镜逐渐进入纳米成像时代。近年来，超分辨光学成像技术的不断发展让光学显微镜与生物医学等领域的联系更加紧密。从光学工程的角度来讲，显微镜技术的性能由一些硬性指标决定，比如成像分辨率、成像深度、定位精度和成像速率等。此外，有效光子数、标记特异性和样品状态等都是在实际的生物应用中获得最佳成像效果的限制因素。因此，一套先进的光学成像系统不仅需要保持被观测样品自身的生物特性，还应该最大程度地保障获取信息的真实性和有效性。
[0004]然而，几乎所有超分辨成像模式在追求超分辨率极限时都会产生新的问题，比如高的激光功率、低的成像速度、复杂的成像系统和昂贵的实验成本等。受激辐射损耗技术损耗激光功率极高，导致严重的样品损伤和染料光漂白，因此不适合细胞等活体样品的长时间超分辨成像；单分子定位显微镜技术需要图像重构，因此时间分辨率低，且成像深度有限，限制了在生物样品动态成像中的应用。总之，目前的超分辨成像技术在实现三维、多色和深层超分辨成像时仍然面临成像系统复杂、成本高、图像质量低和样品制备过程复杂，以及需要特殊荧光探针等一系列问题。
[0005]基于此，提出了一种荧光发射比率超分辨成像方法。

技术实现思路

[0006]本专利技术所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种荧光发射比率超分辨成像方法，降低超分辨技术对荧光染料和样品制备的要求，拓宽染料的选择范围，为低成本的活体超分辨成像研究提供技术支撑，解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0007]为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：一种荧光发射比率超分辨成像方法，包括脉冲激光器，所述脉冲激光器发出的激光经过半波片，再经过格兰激光棱镜，经
过格兰激光棱镜分成两束激光，其中一束激光传向高速光电二极管探测器，另一束激光传向第一分束器，经过分束器再次分成两束激光，分别照向第一反射镜和螺旋相位板；
[0008]经过螺旋相位板的激光传向第二反射镜，经过第二反射镜后传向角反射器；
[0009]经过第一反射镜的激光传向第二分束器，经过第二分束器再次分成两束，分别传向角反射器和第三反射镜；
[0010]经过第三反射器的激光依次通过双色镜、振镜、扫描透镜、管镜和四分之一玻片后，通过物镜聚焦后照射至载物台的样品上。
[0011]进一步的，所述高速光电二极管探测器连接有时间相关单光子计数器，所述时间相关单光子计数器连接有计算机。
[0012]进一步的，所述载物台的样品被激发后产生荧光，荧光被物镜收集后经四分之一玻片、管镜、扫描透镜、振镜和双色镜，被双色镜反射后经过滤光片到达光电倍增管，所述滤光片用于去除荧光以外的杂散光，提高图像信噪比，时间相关单光子计数器同时接收高速光电二极管探测器和光电倍增管采集的参考信号和荧光信号，并将数据传输至计算机进行存储和处理。
[0013]进一步的，所述脉冲激光器由皮秒激光器产生40MHz脉冲型激发光，所述半波片用于调节激光的偏振方向，所述格兰激光棱镜用于分离不同偏振方向的激光。
[0014]进一步的，所述螺旋相位板用于将激光的波前由高斯型转换成环形，所述角反射器通过延长或缩短环型激发光斑的光程在时间上控制高斯型激光和环形激光之间的脉冲间隔。
[0015]进一步的，所述双色镜用于透射激发光，并反射荧光信号；
[0016]所述振镜用于对激发光进行同步扫描，实现对样品的面阵成像；
[0017]所述扫描透镜用于收集面阵扫描的激光光束。
[0018]进一步的，所述物镜用于将激光聚焦到焦平面，同时收集样品反射回来的荧光信号，所述管镜与所述物镜搭配构成显微镜系统。
[0019]进一步的，所述四分之一玻片用于将线偏振激光转换成右旋圆偏振光。
[0020]进一步的，所述载物台用于放置和固定样品，并对样品进行三维移动。
[0021]进一步的，所述第一分束器和第二分束器分别用于激光分束或合束，所述第一反射镜、第二反射镜和第三反射镜分别用于改变激光的传输方向。
[0022]本专利技术与现有技术相比具有以下优点：
[0023]本专利技术中的在低激光功率下突破光学衍射极限的荧光发射比率纳米显微成像技术，降低超分辨技术对荧光染料和样品制备的要求，拓宽染料的选择范围，为低成本的活体超分辨成像研究提供技术支撑。
附图说明
[0024]图1是本专利技术实施例提供的荧光发射比率纳米显微成像的系统光路图；
[0025]图2是本专利技术实施的荧光发射比率纳米显微成像原理图；
[0026]图3是本专利技术实施的荧光发射比率纳米显微图像各像素灰度值的判定方式；
[0027]图4是本专利技术实施的荧光发射比率纳米显微成像的理论模拟结果。
[0028]附图标记说明：
[0029]脉冲激光器1、半波片2、格兰激光棱镜3、第一分束器4、第一反射镜5、螺旋相位板6、第二分束器7、第三反射镜8、第二反射镜9、角反射器10、高速光电二极管探测器11、时间相关单光子计数器12、计算机13、光电倍增管14、双色镜15、滤光片16、振镜17、扫描透镜18、管镜19、四分之一玻片20、物镜21和载物台22。
具体实施方式
[0030]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0031]如图1
‑
4所示，本专利技术提供一种技术方案：一种荧光发射比率超分辨成像方法，包括脉冲激光器1，所述脉冲激光器1发出的激光经过半波片2，再经过格兰激光棱镜3，所述脉冲激光器1由皮秒激光器产生40MHz脉冲型激发光，所述半波片2用于调节激本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种荧光发射比率超分辨成像方法，其特征在于：包括脉冲激光器(1)，所述脉冲激光器(1)发出的激光经过半波片(2)，再经过格兰激光棱镜(3)，经过格兰激光棱镜(3)分成两束激光，其中一束激光传向高速光电二极管探测器(11)，另一束激光传向第一分束器(4)，经过分束器(4)再次分成两束激光，分别照向第一反射镜(5)和螺旋相位板(6)；经过螺旋相位板(6)的激光传向第二反射镜(9)，经过第二反射镜(9)后传向角反射器(10)；经过第一反射镜(5)的激光传向第二分束器(7)，经过第二分束器(7)再次分成两束，分别传向角反射器(10)和第三反射镜(8)；经过第三反射器(8)的激光依次通过双色镜(15)、振镜(17)、扫描透镜(18)、管镜(19)和四分之一玻片(20)后，通过物镜(21)聚焦后照射至载物台(22)的样品上。2.根据权利要求1所述的一种荧光发射比率超分辨成像方法，其特征在于，所述高速光电二极管探测器(11)连接有时间相关单光子计数器(12)，所述时间相关单光子计数器(12)连接有计算机(13)。3.根据权利要求2所述的一种荧光发射比率超分辨成像方法，其特征在于，所述载物台(22)的样品被激发后产生荧光，荧光被物镜(21)收集后经四分之一玻片(20)、管镜(19)、扫描透镜(18)、振镜(17)和双色镜(15)，被双色镜(15)反射后经过滤光片(16)到达光电倍增管(14)，所述滤光片(16)用于去除荧光以外的杂散光，提高图像信噪比，时间相关单光子计数器(12)同时接收高速光电二极管探测器(11)和光电倍增管(14)采集的参考信号和荧光信号，并将数据传输...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈越，郭嘉庆，李灏，王璐玮，俞宪同，陈钰，宋军，屈军乐，
申请(专利权)人：深圳大学，
类型：发明
国别省市：