一种混合胶质细胞共培养体系模型的构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种混合胶质细胞共培养体系模型的构建方法与应用，本发明专利技术采用原代分离并培养新生SD大鼠大脑皮质神经胶质细胞的方法，通过严格控制鼠龄、细胞种植密度、加液量、换液间隔及总培养天数，免疫荧光染色和流式细胞术检测混合胶质细胞中星形胶质细胞与小胶质细胞数量，确定两者比例，判定胶质细胞微环境的体外构建是否成功。本发明专利技术所构建的胶质细胞共培养体系模型可模拟脑内神经胶质细胞微环境，且具有稳定、步骤简单、原材料种类及需求量小、时间成本低、细胞培养初学者也可上手的优点。为研究胶质细胞之间、胶质细胞微环境作为整体与周围环境(细胞

【技术实现步骤摘要】
一种混合胶质细胞共培养体系模型的构建方法与应用


[0001]本专利技术属于神经生物学领域，涉及一种模拟脑内神经胶质细胞微环境的细胞共培养体系模型的构建方法与应用。

技术介绍

[0002]神经干细胞(neural stem cell，NSCs)是一类来自神经系统的具有自我更新能力并且可以向神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞方向分化的细胞。微环境是指某组织的特定解剖位置的周围环境。微环境影响神经发育和再生中NSCs的增殖和分化行为，研究NSCs微环境具有十分重要的意义，有望为开发基于干细胞的神经损伤修复及疾病治疗新策略提供重要的实验依据。
[0003]NSCs微环境的成分复杂，包括细胞、细胞因子、细胞外基质、血管及物理化学因素等，又可细分为成百上千种。现有研究主要集中在环境中单一因素的影响，很少关注多个因素的联合作用，尤其缺乏对由多细胞类型构成的复杂微环境的探索。
[0004]小胶质细胞和星形胶质细胞作为哺乳动物出生后大脑中主要的胶质细胞类型，是NSCs微环境的重要构成成分。当发育进程改变或神经损伤等刺激因素出现，胶质细胞微环境响应刺激，细胞构筑和分泌因子种类和数量随之改变，进而影响NSCs的行为。
[0005]目前现有关于模拟脑内混合胶质细胞微环境的技术中存在诸多缺陷，其一，现有研究NSCs微环境成分的技术方法多为某种或某类分子，如CNTF(DOI:10.1111/ejn.13382)；单种细胞，如小胶质细胞(10.1016/j.bbrc.2018.07.130)。尚缺乏可模拟脑内混合胶质细胞微环境的稳定模型，更缺少有关其应用的研究。其二，现有技术单独分离纯化小胶质细胞和星形胶质细胞，以特定比例混合，以构建混合胶质细胞培养体系，但操作步骤繁琐，污染概率大，细胞状态差(易损伤)、产量低及耗时长等问题。其三，部分现有技术虽然直接使用原代混合胶质细胞，但未明确鼠龄、换液间隔天数、换液量及培养天数等操作关键指标，未对原代混合培养体系中小胶质细胞和星形胶质细胞的数量及比例进行鉴定，不同批次之间可比性差，因此尚不能称为稳定的胶质细胞共培养模型(10.4103/1673
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5374.306093)。

技术实现思路

[0006]为解决上述问题，本专利技术旨在构建一个稳定的、重复性好、且能够有效模拟脑内神经胶质细胞微环境的细胞共培养体系。为达成这一目的，本专利技术提出了“一种小胶质细胞和星形胶质细胞的共培养体系模型的构建方法”，该方法可模拟脑内神经胶质细胞微环境，为研究胶质细胞之间、胶质细胞微环境作为整体与周围环境(细胞、血管及细胞分子)间的相互作用及分子机制提供模型。
[0007]首先，本专利技术进行了原代混合胶质细胞分离与培养，具体包括：
[0008]1.分离脑组织
[0009]取7只新生(出生24hrs内)SD大鼠的完整脑组织，置于预冷PBS液的无菌小平皿中。
[0010]2.制作单细胞悬液
[0011]尽可能的剥净脑膜与血管，取出大脑皮层，加入适量预冷的基础培养基，用眼科剪将皮层组织剪成小块，用移液枪缓慢轻柔吹打至组织块消失(肉眼不可见)。经滤网过滤后收集于离心管中，离心、弃上清液，加入提前37℃温浴的含有10％FBS、1％STP的DMEM
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High Glucose培养基，重悬制成单细胞悬液。
[0012]3.混合胶质细胞培养
[0013]将上述单细胞悬液种植于3个PLL(多聚赖氨酸)包被后的T25培养瓶，置于培养箱中培养。30hrs后待胶质细胞贴壁进行第一次换液，并尽可能去除组织块或杂细胞，之后每4d换一次液，直至第13d，Tryple Express消化、收集细胞，进行免疫荧光染色和流式细胞仪检测。
[0014]特别地，本专利技术在上述步骤中有以下两点操作细节：第一，30hrs后第一次换液，尽可能确保小胶质细胞和星形胶质细胞的贴附，吹打轻柔且需彻底，尽可能去除杂细胞或组织团块。第二，消化收集细胞时注意消化彻底，避免贴壁较牢的星形胶质细胞数量损失。
[0015]本专利技术还对提供的混合胶质细胞共培养体系进行鉴定，包括光镜观察、免疫荧光染色与流式细胞双染鉴定。
[0016]特别地，本专利技术中免疫荧光一抗为兔抗Iba1(1:500，Wako)和小鼠抗GFAP(1:500，Cell Signaling Technology)，流式细胞染色分析的抗体为小鼠抗CD11b直标APC单克隆抗体(BD Biosciences)，小鼠抗GFAP直标Alexa Fluor 488抗体(Thermo Fisher Scientific)；免疫荧光二抗分别为山羊抗兔Alexa Fluor 594荧光二抗(1:500，abcam)及山羊抗鼠Alexa Fluor 488荧光二抗(1:500，Novus)。
[0017]进一步地，本专利技术通过免疫荧光染色和流式细胞染色分析，双重确认小胶质细胞和星形胶质细胞比例，确保模型稳定。
[0018]此外，本专利技术还提供了上述混合胶质细胞共培养体系模型的应用，具体包括以下几方面：第一，胶质细胞共培养体系模型对NSCs形态活力、增殖、分化行为的影响及分子机制。第二，LPS(脂多糖)等因素刺激下胶质细胞之间的相互作用。第三，LPS刺激下胶质细胞之间相互作用的分子机制。
[0019]通过上述技术方案，结合实施例本专利技术所提供的混合胶质细胞共培养体系模型，至少具有下述有益效果或优点：
[0020]1.本专利技术构建的混合胶质细胞共培养体系模型稳定、重复性好、细胞产量稳定，小胶质细胞和星形胶质细胞的总数超过混合培养体系的90％。
[0021]2.本专利技术构建的混合胶质细胞共培养体系模型中小胶质细胞和星形胶质细胞的比例接近于1:2，和脑内两种胶质细胞比例吻合。
[0022]3.本专利技术所模拟的胶质细胞微环境可以促进NSCs活力，改变NSCs形态。
[0023]4.本专利技术构建的混合胶质细胞共培养体系模型能够抑制NSCs的增殖行为，抑制其向神经元方向分化。
[0024]5.本专利技术构建的混合胶质细胞共培养体系模型能够促进NSCs向星形胶质细胞分化。
[0025]6.本专利技术构建的混合胶质细胞共培养体系模型能表达并分泌BMP4蛋白。
[0026]7.本专利技术构建的混合胶质细胞共培养体系模型能促进NSCs的P
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Smad1/5/8蛋白及P
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Stat3蛋白表达。
[0027]8.本专利技术构建的混合胶质细胞共培养体系模型能够通过BMP4
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Smad1/5/8信号通路，减弱NSCs增殖并诱导星形胶质细胞分化。
[0028]9.本专利技术构建的混合胶质细胞共培养体系模型随着LPS刺激浓度的提高，小胶质细胞和星形胶质细胞的交互作用明显，可用于脑科学及脑疾病研究。
[0029]10.本专利技术构建的混合胶质细胞共培养体系模型在高浓度LPS刺激下可表达LCN2蛋白，能够用于探究小胶质细胞和星形胶质细胞间相互作用的分子机制。<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种混合胶质细胞共培养体系模型的构建方法，其特征在于，分离新生(出生24hrs内)SD大鼠的脑组织；制作原代单细胞悬液；培养混合胶质细胞。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，7只新生SD大鼠提取的原代细胞平均对应3个T25培养瓶。3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法无需使用胰酶，直接用枪头吹匀制作单细胞悬液。4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，细胞培养时，每4d换一次液，每次4ml。5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，胶质细胞的培养基为含有10％FBS(胎牛血清)、1％STP(青霉素
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链霉素双抗)的DMEM
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High Glucose培养基。6.一种混合胶质细胞共培养体系模型，其特征在于，通过权利要求1
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5任一项所述构建方法构建。7.根据权利要求6所述的细胞共培养体系模型，其特征在于，所述模型能够模拟脑内神经胶质细胞微环境。8.权利要求6或7任一项所述细胞共培养体系模型的鉴定方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙美琪，吕海侠，安晶，胡晓宣，葛茜，张子宣，宋轶群，谭若兰，蔡振陆，
申请(专利权)人：西安交通大学，
类型：发明
国别省市：