非病毒DNA载体和其用于表达因子IX治疗剂的用途制造技术

本申请描述了用于递送和表达转基因的具有线性且连续结构的ceDNA载体。ceDNA载体包含通过两个ITR序列侧接的表达盒，其中所述表达盒编码了编码FIX蛋白的转基因。一些ceDNA载体进一步包含顺式调节元件，所述顺式调节元件包括调节开关。本文进一步提供了使用所述ceDNA载体进行可靠的体外、离体和体内FIX蛋白基因表达的方法和细胞系。本文提供了包含可用于在细胞、组织或受试者中表达FIX蛋白的ceDNA载体的方法和组合物以及用表达FIX蛋白的所述ceDNA载体治疗疾病的方法。所述FIX蛋白能够被表达以治疗疾病，例如B型血友病。例如B型血友病。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】非病毒DNA载体和其用于表达因子IX治疗剂的用途
[0001]相关申请
[0002]本申请要求2020年3月24日提交的美国临时申请第62/993,857号的优先权，所述申请的全部内容通过引用以其全文并入本文中。
[0003]序列表
[0004]本申请含有序列表，其已经以ASCII格式电子提交并在此通过全文引用的方式并入。所述ASCII副本创建于2021年3月22日，被命名为131698
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06520_SL.txt并且大小为394,694字节。


[0005]本公开涉及基因疗法领域，所述基因疗法包括用于在受试者或细胞中表达转基因或经分离多核苷酸的非病毒载体。本公开还涉及核酸构建体、启动子、载体和宿主细胞，包括多核苷酸，以及将外源DNA序列递送至靶细胞、组织、器官或生物体的方法。举例来说，本公开提供了使用非病毒ceDNA载体从细胞表达FIX，例如表达FIX治疗蛋白以治疗患有B型血友病的受试者的方法。所述方法和组合物可以例如出于通过在有需要的受试者的细胞或组织中表达FIX蛋白来治疗疾病的目的来应用。

技术介绍

[0006]基因疗法旨在改善患有因基因表达谱畸变引起的基因突变或获得性疾病的患者的临床结果。基因疗法包括治疗或预防由可能导致病症、疾病、恶性病等的缺陷基因或异常基因调节或表达，例如表达不足或过表达导致的医学病况。举例来说，由缺陷基因造成的疾病或病症可以通过向患者递送矫正性遗传物质来加以治疗、预防或改善，或可以通过例如对患者用矫正性遗传物质改变缺陷基因或使缺陷基因沉默，从而引起遗传物质在患者体内进行治疗性表达来加以治疗、预防或改善。
[0007]基因疗法的基础是向转录盒提供活性基因产物(有时称为转基因)，例如能够产生正向功能获得效应、负向功能丧失效应或另一结果的活性基因产物。此类结果能够归因于活化抗体或融合蛋白或抑制(中和)抗体或融合蛋白的表达。基因疗法也可以用于治疗由其它因素引起的疾病或恶性疾病。人类单基因性病症为由单一基因变化造成的病症，可以通过将正常基因递送到靶细胞并进行表达来加以治疗。矫正基因在患者目标细胞中的递送和表达可以通过多种方法进行，包括使用工程化病毒和病毒基因递送载体。在许多可用的病毒来源载体(例如，重组逆转录病毒、重组慢病毒、重组腺病毒等)当中，重组腺相关病毒(recombinant adeno
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associated virus；rAAV)作为基因疗法中的多用途载体越来越受到欢迎。
[0008]腺相关病毒(AAV)属于细小病毒科(Parvoviridae family)，并且更具体地说，构成依赖病毒属(Dependoparvovirus genus)。衍生自AAV的载体(即，rAVV或AAV载体)对于递送遗传物质具有吸引力，因为(i)它们能够感染(转导)广泛多种的非分裂和分裂细胞类型，包括肌细胞和神经元；(ii)它们不含病毒结构基因，由此减弱了宿主细胞对病毒感染的反
应，例如干扰素介导的反应；(iii)野生型病毒被认为在人类中是非病理性的；(iv)与能够整合到宿主细胞基因组中的野生型AAV形成相比，复制缺陷型AAV载体缺乏复制(rep)基因，并且一般作为附加体存留，因此限制了插入突变形成或基因毒性的风险；以及(v)与其它载体系统相比，AAV载体一般被认为是相对较弱的免疫原，并且因此不会触发显著的免疫反应(参见ii)，因此获得了载体DNA的存留性以及治疗性转基因的潜在长期表达。
[0009]然而，使用AAV粒子作为基因递送载体存在几个主要缺陷。与rAAV相关的一个主要缺点是其对异源DNA的约4.5kb的病毒封装容量有限(Dong等人，1996；Athanasopoulos等人，2004；Lai等，2010)，因此AAV载体的使用已限于小于150,000Da蛋白质编码容量。第二个缺点是，由于人群中野生型AAV感染盛行，所以必须筛查rAAV基因疗法候选者中从患者消除所述载体的中和抗体的存在。第三个缺点与衣壳免疫原性有关，所述免疫原性阻止了对未从初始治疗中排除的患者进行再施用。患者的免疫系统可以对有效充当“强化”注射的所述载体作出反应，以刺激免疫系统产生高滴度的抗AAV抗体，从而杜绝了进一步治疗。最近的一些报告指出在高剂量情况下对免疫原性的顾虑。另一个值得注意的缺点是，鉴于在异源基因表达之前必须将单链AAV DNA转化为双链DNA，所以AAV介导的基因表达的启动相对较慢。
[0010]另外，通过引入一个或多个含有AAV基因组、rep基因和cap基因的质粒，产生有衣壳的常规AAV病毒体(Grimm等人,1998)。然而，发现这种衣壳化AAV病毒载体不能有效地转导某些细胞和组织类型，并且衣壳还诱导免疫反应。
[0011]相应地，由于单次施用于患者(因患者免疫反应)、适于AAV载体递送的转基因遗传物质的范围因最小病毒封装容量(约4.5kb)而受限，以及AAV介导的基因表达缓慢，因此基因疗法使用腺相关病毒(AAV)载体受到限制。
[0012]对B型血友病的疾病调节疗法存在大量未满足的要求。当前疗法为难以承担的并且需要频繁的静脉内(IV)施用。首先，这些因子IX可注射剂不提供因子的连续递送，其中低谷水平允许出血事件。其次，不存在审批通过的针对B型血友病的基因疗法，并且由于预先存在的抗体，基于AAV的疗法无法被25％到40％的患者使用。AAV仅可以施用一次，并且所产生的因子IX含量可能不够高而无效，或可能为超常的，无法滴定剂量水平。第三，一些B型血友病患者由于中和抗体发展成这些外源性人工凝血因子而无法利用这些疗法。
[0013]因此，所属领域需要准许治疗性FIX蛋白在细胞、组织或受试者中表达以治疗B型血友病的技术。

技术实现思路

[0014]本文所描述的技术涉及通过由具有共价封闭端的无衣壳(例如非病毒)DNA载体(在本文中称为“封闭端DNA载体”或“ceDNA载体”)表达因子IX(FIX)蛋白来治疗B型血友病的方法和组合物，其中ceDNA载体包含FIX核酸序列或其经密码子优化型式。可以使用这些ceDNA载体产生用于治疗、监测和诊断的FIX蛋白。向受试者施用表达FIX的ceDNA载体以治疗B型血友病为有用的：(i)提供疾病调节含量的FIX酶，在递送中具微创性，可重复并且给药时生效，具有快速起效的治疗作用，引起矫正性FIX酶在肝中持久表达，恢复凝血级联，和/或可滴定以实现适当的药理学含量的缺陷酶。
[0015]在一些实施例中，表达FIX的ceDNA载体任选地存在于脂质体纳米粒子配制物
(LNP)中以治疗B型血友病。本文所描述的ceDNA LNP配制物可以提供一种或多种益处，包括：提供疾病调节含量的FIX蛋白，在递送中具微创性，可重复并且给药时生效，具有通常在治疗性干预数天内快速起效的治疗作用，在循环中具有矫正性FIX含量的持久表达，可滴定以实现适当的药理学含量的缺陷凝血因子，和/或提供针对其它类型的血友病的治疗，所述其它类型的血友病包括但不限于因子VII缺陷。
[0016]因此，本公本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种无衣壳封闭端DNA(ceDNA)载体，其包含：在侧接反向末端重复序列(ITR)之间的至少一个核酸序列，其中所述至少一个核酸序列编码至少一种FIX蛋白。2.根据权利要求1所述的ceDNA载体，其中编码至少一种FIX蛋白的所述至少一个核酸序列选自表1中所阐述的序列或表12中所列的任何ceDNA序列中所包括的任何开放阅读框(ORF)序列中的任一个。3.根据权利要求1或2所述的ceDNA载体，其中所述ceDNA载体包含可操作地连接到编码至少一种FIX蛋白的所述至少一个核酸序列的选自表7中的任一个启动子序列的启动子序列。4.根据权利要求1至3中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ceDNA载体包含选自表8中的任一个增强子序列的增强子序列。5.根据权利要求1至4中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ceDNA载体包含选自表9A中的任一个5'UTR和/或内含子序列的5'UTR和/或内含子序列。6.根据权利要求1至5中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ceDNA载体包含选自表9B中的任一个3'UTR序列的3'UTR序列。7.根据权利要求1至6中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ceDNA载体包含至少一个选自表10中的任一个聚A序列的聚A序列。8.根据权利要求1至7中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ceDNA载体包含可操作地连接到至少一个核酸序列的至少一个启动子序列。9.根据权利要求1至8中任一项所述的ceDNA载体，其中所述至少一个核酸序列为cDNA。10.根据权利要求1至9中任一项所述的ceDNA载体，其中至少一个ITR包含功能末端解链位点及Rep结合位点。11.根据权利要求1至10中任一项所述的ceDNA载体，其中一个或两个所述ITR来自选自细小病毒(Parvovirus)、依赖病毒(Dependovirus)和腺相关病毒(AAV)的病毒。12.根据权利要求1至11中任一项所述的ceDNA载体，其中所述侧接ITR相对于彼此对称或不对称。13.根据权利要求12所述的ceDNA载体，其中所述侧接ITR对称或基本上对称。14.根据权利要求12所述的ceDNA载体，其中所述侧接ITR不对称。15.根据权利要求1至14中任一项所述的ceDNA载体，其中一个或两个所述ITR为野生型的，或其中两个所述ITR为野生型ITR。16.根据权利要求1至15中任一项所述的ceDNA载体，其中所述侧接ITR来自不同病毒血清型。17.根据权利要求1至16中任一项所述的ceDNA载体，其中所述侧接ITR选自表2中示出的任何病毒血清型对。18.根据权利要求1至17中任一项所述的ceDNA载体，其中一个或两个所述ITR包含选自表3中的一个或多个序列的序列。19.根据权利要求1至18中任一项所述的ceDNA载体，其中至少一个所述ITR由野生型AAV ITR序列通过影响所述ITR的总体三维构象的缺失、添加或取代进行改变。20.根据权利要求1至19中任一项所述的ceDNA载体，其中一个或两个所述ITR衍生自选
自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12的AAV血清型。21.根据权利要求1至20中任一项所述的ceDNA载体，其中一个或两个所述ITR为合成的。22.根据权利要求1至21中任一项所述的ceDNA载体，其中一个或两个所述ITR不为野生型ITR，或其中两个所述ITR不为野生型ITR。23.根据权利要求1至22中任一项所述的ceDNA载体，其中一个或两个所述ITR通过至少一个选自A、A'、B、B'、C、C'、D和D'的ITR区中的缺失、插入和/或取代进行修饰。24.根据权利要求23所述的ceDNA载体，其中所述缺失、插入和/或取代引起通常通过所述A、A'、B、B'、C或C'区形成的茎
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环结构全部或部分的缺失。25.根据权利要求1至24中任一项所述的ceDNA载体，其中一个或两个所述ITR通过引起通常通过所述B和B'区形成的茎
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环结构全部或部分的缺失的缺失、插入和/或取代进行修饰。26.根据权利要求1至24中任一项所述的ceDNA载体，其中一个或两个所述ITR通过引起通常通过所述C和C'区形成的茎
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环结构全部或部分的缺失的缺失、插入和/或取代进行修饰。27.根据权利要求1至24中任一项所述的ceDNA载体，其中一个或两个所述ITR通过引起通常通过所述B和B'区形成的茎
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环结构部分和/或通常通过所述C和C'区形成的茎
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环结构部分的缺失的缺失、插入和/或取代进行修饰。28.根据权利要求1至27中任一项所述的ceDNA载体，其中一个或两个所述ITR包含通常包含通过所述B和B'区形成的第一茎
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【专利技术属性】
技术研发人员：D，
申请(专利权)人：世代生物公司，
类型：发明
国别省市：