细胞冻存方法和细胞复苏方法技术

本发明专利技术公开了细胞冻存方法和细胞复苏方法。本发明专利技术的细胞冻存方法，包括使用WAVE生物反应器以灌流培养方式培养细胞的步骤、将培养的细胞进行浓缩得到高密度细胞的步骤、以及将高密度细胞进行冻存得到冻存细胞的步骤。本发明专利技术的细胞复苏方法包括将采用本发明专利技术的细胞冻存方法冻存的细胞融化后，不经种子细胞逐级扩增、直接接种至WAVE生物反应器的细胞培养袋中的步骤。的步骤。

【技术实现步骤摘要】
细胞冻存方法和细胞复苏方法


[0001]本专利技术涉及细胞发酵工程
具体地，本专利技术涉及一种细胞冻存和细胞复苏方法。

技术介绍

[0002]当前，细胞发酵工程是生产单克隆抗体等重组蛋白的主要技术手段。其中，灌流培养作为哺乳动物细胞培养的一种工艺，一方面向生物反应器内连续补加新鲜培养基，另一方面又将包含发酵产物的反应液不断取出，使细胞留在生物反应器内并持续处于营养状态，能够维持更长的细胞发酵生产时间。
[0003]WAVE摇袋式细胞培养生物反应器(简称WAVE或 WAVE 生物反应器)是美国GE公司产品，是目前细胞灌流培养工艺中采用的主流生物反应器之一，其适用于培养各种类型的细胞，包括CHO、NSO、杂交瘤、HEK293、T细胞、植物细胞和初级人类细胞株。在WAVE生物反应器中，细胞及培养基被置于一个称作细胞培养袋(Cellbags)的预先经辐照灭菌的塑料袋中，该细胞培养袋有不同的规格， 配合不同规格的WAVE生物反应器使用可以实现从0.1升到500升体积范围的细胞培养。
[0004]一般而言，使用WAVE生物反应器工业规模生产包括单克隆抗体在内的重组蛋白，配套的细胞培养袋的工作体积至少为5L，且需要其中接种的细胞达到3
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105细胞/mL左右。另一方面，生产用细胞株的工作细胞库是冷冻保存的，冻存细胞密度为1
×
107~2
×
107细胞/mL。由于冻存工作细胞库的数量有限，通常希望在一次生产中用于复苏的冻存细胞的体积在10mL以下。若一次使用10mL以下的冻存细胞体积进行复苏，则其中的种子细胞含量至多能支持700mL左右的复苏体积，如果将其直接接种于工作体积5L以上的WAVE生物反应器细胞培养袋，则细胞无法继续生长。
[0005]因此，从工作细胞库到WAVE生物反应器的细胞培养袋，需要对种子细胞进行逐级扩增，以累积足够接种至生产规模的WAVE生物反应器的细胞量。但种子细胞的逐级扩增需要大量的时间，这延长了整个上游细胞培养的周期。
[0006]另一方面，若希望以10mL以下的冻存体积支持5L左右的复苏体积，则冻存细胞库中的细胞密度需要达到1.5
×
108细胞/mL以上。可以通过高密度细胞冻存构建工作细胞库以避免逐级扩增，一种方法是采用灌流培养技术制备高密度细胞，另一种方法是采用浓缩技术制备高密度细胞，但如果要达到1.5
×
108细胞/mL以上的细胞密度，采用前一种方法需要耗费大量培养基且对培养设备负载能力有要求，而采用后一种方法会伤害细胞、降低细胞存活率，导致实际的细胞密度达不到直接复苏至WAVE阶段的要求。
[0007]因此，需要开发一种工作细胞冻存及复苏方法，使得能够不经过种子细胞逐级扩增，将工作细胞库复苏后直接接种于WAVE生物反应器的细胞培养袋，且细胞保持良好的生长状态。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的在于提供一种细胞冻存和复苏方法，通过该方法冻存和复苏的细胞能够不经过种子细胞逐级扩增、直接接种于WAVE生物反应器的细胞培养袋(工作体积为5L以上)。本专利技术的细胞冻存及复苏方法适用于包括单克隆抗体在内的重组蛋白的生产用细胞株的冻存和复苏。
[0009]本专利技术的技术方案包括：1. 一种细胞冻存方法，其包括：步骤A：使用WAVE生物反应器以灌流培养方式培养细胞，使该WAVE生物反应器的细胞培养袋(Cellbags)中的细胞密度为3
×
107细胞/mL~8
×
107细胞/mL；步骤B：使用预冷培养基灌流置换所述细胞培养袋中的培养基，至所述细胞培养袋中的培养基的温度低于25℃；所述预冷培养基是已预先冷却至4~10℃的培养基；步骤C：加入细胞培养袋中的培养基0.5~2倍体积的预冷DMSO培养基，该预冷DMSO培养基是已预先冷却至4~10℃的、包含5~15体积%的二甲基亚砜(即DMSO)的培养基，然后通过快速出液操作进行浓缩；该步骤C视需要进行1次以上，直至细胞培养袋中的细胞密度为1.5
×
108细胞/mL以上；步骤D：将留在细胞培养袋中的细胞转移至接种瓶中，再分装至细胞冻存管或细胞冻存袋中，然后于37℃放置0.5~1小时，再进行冻存。
[0010]本专利技术中可以使用任何可用于细胞培养的培养基，例如CD CHO培养基、Actipro培养基、Eden
‑
B600培养基或其它商品培养基。
[0011]2. 根据项1所述的细胞冻存方法，其中，所述步骤A中该WAVE生物反应器的细胞培养袋中的细胞密度为4
×
107细胞/mL以上。
[0012]3. 根据项1所述的细胞冻存方法，其中，所述步骤C中的预冷DMSO培养基包含8~12体积%的二甲基亚砜。
[0013]4. 根据项1所述的细胞冻存方法，其中，所述步骤C视需要进行1次以上，直至细胞培养袋中的细胞密度为1.6
×
108细胞/mL以上且2
×
108细胞/mL以下。
[0014]5. 根据项1所述的细胞冻存方法，其中，所述步骤D中使用细胞冻存管进行冻存，冻存条件为
‑
80℃保存12~24小时
→‑
196℃液氮中长期保存。
[0015]6. 根据项1所述的细胞冻存方法，其中，所述步骤D中使用细胞冻存袋进行冻存，冻存条件为4℃保存30分钟
→‑
20℃保存1小时
→‑
80℃保存12~24小时
→‑
196℃液氮中长期保存。
[0016]7. 根据项1所述的细胞冻存方法，其冻存的细胞为用于生产重组蛋白的细胞株。所述细胞株例如CHO、CHO—DBXll、CHO—DG44、 CHO—S、CHO—Kl、Vero、BHK、HeLa、COS、MDCK、HEK—293、NIH—3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT20、T47D、NSO、CRL7030、HsS78Bst细胞、PER.C6、SP2/0—Agl4以及杂交瘤细胞。
[0017]8. 一种细胞复苏方法，其包括：将细胞冻存管或细胞冻存袋置于25~40℃的温水中，所述细胞冻存管或细胞冻存袋中装有冻存细胞，所述冻存细胞采用项1~7中任一项所述的细胞冻存方法冻存，待所述冻存细胞融化后，直接将其转移至WAVE生物反应器的细胞培养袋中，所述细胞培养袋中装有培养基；
其中，转移至所述细胞培养袋中的所述融化的冻存细胞的体积V1与所述细胞培养袋中装有培养基的体积V2满足：V2/V1=400~600。
[0018]9. 根据项8所述的细胞复苏方法，其中，V1为10mL以上且20mL以下。
[0019]专利技术效果采用本专利技术的细胞冻存方法得到的冻存细胞库经复苏后，可不经过种子细胞逐级扩增、以1：500左右的接种比例(冻存细胞体积：复苏培养基体积)直接接种于WAVE生物反应器的细胞培养袋(工作体积为5L以上)，且细胞保持良好的生长状本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种细胞冻存方法，其包括：步骤A：使用WAVE生物反应器以灌流培养方式培养细胞，使该WAVE生物反应器的细胞培养袋中的细胞密度为3
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107细胞/mL~8
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107细胞/mL；步骤B：使用预冷培养基灌流置换所述细胞培养袋中的培养基，至所述细胞培养袋中的培养基的温度低于25℃；所述预冷培养基是已预先冷却至4~10℃的培养基；步骤C：加入细胞培养袋中的培养基0.5~2倍体积的预冷DMSO培养基，该预冷DMSO培养基是已预先冷却至4~10℃的、包含5~15体积%的二甲基亚砜的培养基，然后通过快速出液操作进行浓缩；该步骤C视需要进行1次以上，直至细胞培养袋中的细胞密度为1.5
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108细胞/mL以上；步骤D：将留在细胞培养袋中的细胞转移至接种瓶中，再分装至细胞冻存管或细胞冻存袋中，然后于37℃放置0.5~1小时，再进行冻存。2.根据权利要求1所述的细胞冻存方法，其中，所述步骤A中该WAVE生物反应器的细胞培养袋中的细胞密度为4
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107细胞/mL以上。3.根据权利要求1所述的细胞冻存方法，其中，所述步骤C中的预冷DMSO培养基包含8~12体积%的二甲基亚砜。4.根据权利要求1所述的细胞冻存方法，其中，所述步骤C视需要进行1次以上，直至细胞培养袋中的细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：张寒青，孙月月，王蕾，曹文倩，李建伟，乔怀耀，
申请(专利权)人：江苏赛孚士生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：