以哈维氏弧菌为饵料培养嗜盐蛭弧菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种以哈维氏弧菌为饵料培养嗜盐蛭弧菌的方法，包括以下步骤：S1、哈维氏弧菌为副溶血性弧菌V.harveyi D9

【技术实现步骤摘要】
以哈维氏弧菌为饵料培养嗜盐蛭弧菌的方法


[0001]本专利技术涉及蛭弧菌培养
更具体地说，本专利技术涉及一种以哈维氏弧菌为饵料培养嗜盐蛭弧菌的方法。

技术介绍

[0002]嗜盐蛭弧菌是一类寄生于其他革兰氏阴性细菌的捕食性细菌，普遍存在于土壤、淡水和咸水等自然环境中。嗜盐蛭弧菌不仅具有独一无二的生活史和捕食特性，而且还具有对人体无毒等特性，具有较高的应用价值，可以广泛地作为抗菌生物试剂应用于工业，农业，水产养殖业以及生物制药等领域。有研究表明，采用口服嗜盐蛭弧菌，可以成功抑制幼鸡胃肠道的沙门氏菌的感染。嗜盐蛭弧菌对经济鱼类致病菌嗜水气单胞菌具有良好的抑制作用。
[0003]此外，研究发现嗜盐蛭弧菌对引起水产动物，特别是海水鱼类流行性疾病的一种重要病原哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)具有较好的抑制和杀灭作用。然而，嗜盐蛭弧菌作为专性捕食微生物，生活史复杂，其捕食和生长过程易受各类环境因素影响，不易大量扩繁和规模化获得，限制了其作为微生物菌剂的开发和应用。因而，进一步研究和开发嗜盐蛭弧菌高效快速培养和增殖技术方法很有必要。

技术实现思路

[0004]本专利技术的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
[0005]本专利技术还有一个目的是提供一种以哈维氏弧菌为饵料培养嗜盐蛭弧菌的方法，能够高效快速的培养和增殖嗜盐蛭弧菌。
[0006]为了实现根据本专利技术的这些目的和其它优点，提供了一种以哈维氏弧菌为饵料培养嗜盐蛭弧菌的方法，包括：
[0007]S1、哈维氏弧菌为副溶血性弧菌V.harveyi D9
‑
13，将所述哈维氏弧菌在培养基中进行培养后，洗脱、稀释，获得哈维氏弧菌悬液；
[0008]S2、取嗜盐蛭弧菌进行稀释至其浓度为10
‑5‑
10
‑6，获得嗜盐蛭弧菌悬浮液；
[0009]S3、以所述哈维氏弧菌悬液为宿主，放入所述嗜盐蛭弧菌悬浮液，采用双层平板培养法进行培养。
[0010]优选的是，步骤S1中，所述副溶血性弧菌V.harveyi D9
‑
13使用固体LB培养基进行过夜培养。
[0011]优选的是，步骤S1中，使用50mL的70％ ASW洗脱。
[0012]优选的是，所述嗜盐蛭弧菌的最适生长温度为28℃。
[0013]优选的是，所述嗜盐蛭弧菌的最适生长pH为9.5。
[0014]优选的是，所述嗜盐蛭弧菌的MOI为100:1。
[0015]本专利技术至少包括以下有益效果：
[0016]能够高效快速的培养和增殖嗜盐蛭弧菌。
D9
‑
13的变化相关曲线。
具体实施方式
[0027]下面结合实施例对本专利技术做进一步的详细说明，给出的实施例仅为了阐明本专利技术，而不是为了限制本专利技术的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0028]LB(Luria
‑
Bertani)液体培养基配方：称取胰蛋白胨(Tryptone)10g、酵母提取物(Yeast extract)5g、酵母提取物(Yeast extract)5g，搅拌使之充分溶解，用蒸馏水定容至1000mL，pH调至7.0。分装150mL至500mL三角瓶中，121℃条件下湿热灭菌20min。
[0029]LB(Luria
‑
Bertani)固体培养基配方：称取胰蛋白胨(Tryptone)10g、酵母提取物(Yeast extract)5g、酵母提取物(Yeast extract)5g药品，搅拌使之充分溶解，用蒸馏水定容至1000mL，pH调至7.0。称取琼脂粉，使其浓度为15g/L。分装150mL至500mL三角瓶中，121℃条件下湿热灭菌20min。
[0030]Pp20双层培养基：先取适量LB固体培养基倒入平板冷却凝固。后各取1mL嗜盐蛭弧菌菌悬液、1mL宿主菌菌悬液、1mL 70％人工海水(ASW)置于离心管中，再取LB固体培养基，迅速混匀后倒入已有下层培养基的培养皿中，摇匀铺满平皿。
[0031]实施例1、副溶血性弧菌菌株和蛭弧菌D10
‑
6的菌悬液的制备与培养
[0032]一、宿主菌悬液的制备
[0033]使用固体LB培养基培养宿主菌副溶血性弧菌V.harveyi D9
‑
13，过夜培养后，用50mL的70％ ASW将菌洗脱下来，置于离心管中在4℃冰箱中备用。从中抽取100μL菌悬液经梯度稀释，选取10
‑7，10
‑8进行LB培养基培养，计算宿主菌悬液的浓度，即其CFU。最后置于4℃冰箱保存备用。
[0034]二、蛭弧菌D10
‑
6悬浮液的制备
[0035]从嗜盐蛭弧菌Halobacteriovorax D10
‑
6细胞培养瓶中抽取5mL，采用0.2μm滤膜进行过滤，然后抽取100μL进行梯度稀释，挑选10
‑5，10‑6稀释浓度，并以V.harveyi D9
‑
13作为宿主，采用双层平板培养法进行培养，在28℃的恒温培养箱中培养，观察蛭弧菌在宿主菌的双层平板上的出斑时间，噬菌斑的大小，噬菌斑的数量，计算蛭弧菌菌悬液的浓度，即PFU。最后置于4℃冰箱保存备用。
[0036]实施例2、MOI(Multiple of Infection)对蛭弧菌生长繁殖的影响
[0037]在温度28℃，pH9.5，盐度18.3ppt条件下，分别研究分析以predator:prey为100:1、10：1、1：1、1：10、1：100的比例条件下，蛭弧菌生长繁殖的变化。以predator:prey的比例分别为100:1为例，抽取x mL宿主菌D9
‑
13菌液与y mL嗜盐蛭弧菌菌液混合，在28℃下摇床培养，并且分别在0h，4h，8h，12h，24h，36h，48h，2h抽取100μL进行梯度稀释，选取10
‑5和10
‑6做Pp20双层培养基，测PFU；选取10
‑7和10
‑8做LB培养，测CFU。设置对照组，a组只添加嗜盐蛭弧菌Halobacteriovorax D10
‑
6，b组只添加V.harveyi D9
‑
13，并分别进行三个重复。
[0038]MOI(HBX:V.H)100:1、28℃，70％ ASW(pH＝9.5,salinity＝18.3ppt)条件下嗜盐蛭弧菌Halobacteriovorax D10
‑
6生长繁殖的情况见图1a，0h，初始菌体数量为6.23
×
106个/mL。随着时间的增加，弧菌V.harveyi D9
‑
13数量逐渐减少，72小时后，其种群数量为7.13
×
104个/mL。嗜盐本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.以哈维氏弧菌为饵料培养嗜盐蛭弧菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、哈维氏弧菌为副溶血性弧菌V.harveyi D9
‑
13，将所述哈维氏弧菌在培养基中进行培养后，洗脱、稀释，获得哈维氏弧菌悬液；S2、取嗜盐蛭弧菌进行稀释至其浓度为10
‑5‑
10
‑6，获得嗜盐蛭弧菌悬浮液；S3、以所述哈维氏弧菌悬液为宿主，放入所述嗜盐蛭弧菌悬浮液，采用双层平板培养法进行培养。2.如权利要求1所述的以哈维氏弧菌为饵料培养嗜盐蛭弧菌的方法，其特征在于，步骤S1中，所述副溶血性弧菌V.ha...

【专利技术属性】
技术研发人员：李楠，徐强胜，赵华显，唐金利，姜宫凌侠，
申请(专利权)人：南宁师范大学，
类型：发明
国别省市：