本公开涉及破伤风抗毒素制备技术领域，涉及一种破伤风抗毒素的纯化方法、层析填料及破伤风抗毒素，其中，纯化方法包括：使用装填有层析填料的层析柱对含有破伤风抗毒素的制品溶液进行层析处理，以对所述制品溶液进行纯化，得到破伤风抗毒素；其中，所述层析填料偶联有用于特异性结合破伤风抗体的亲和物质。本申请使用含有亲和物质的层析填料吸附蛋白溶液中的破伤风抗毒素，并调整适宜的条件使破伤风抗毒素解吸附，以对所述制品溶液进行纯化，得到破伤风抗毒素，实现了破伤风抗体效价的富集。通过本工艺生产的破伤风抗毒素，蛋白纯度更高、血浆综合利用率达到提升、提高了破伤风抗毒素市场供给量。毒素市场供给量。毒素市场供给量。
【技术实现步骤摘要】
一种破伤风抗毒素的纯化方法、层析填料及破伤风抗毒素
[0001]本公开涉及破伤风抗毒素制备
，具体涉及一种破伤风抗毒素的纯化方法、层析填料及破伤风抗毒素。
技术介绍
[0002]破伤风抗毒素是一种马抗血清制品，它能中和血液中破伤风梭菌产生的破伤风毒素，缓解破伤风症状和降低病死率。当前破伤风抗毒素的生产工艺主要为破伤风类毒素免疫马匹后采集的血浆经胃蛋白酶消化，后者在IgG铰链区二硫键的近羧基端处将其剪切为F(ab')2片段和若干无生物活性的小分子多肽pFc'片段，然后去除大量白蛋白、可溶性杂质及Fc片段，最后超滤除盐、浓缩和去小分子蛋白。《中国药典》2015版破伤风抗毒素检验项下F(ab')2含量标准规定预防用及治疗用从2010版的应不低于50％及60％提升到了应不低于60％及70％，同时IgG含量也从应不高于10％降低为应不高于5％。可见针对破伤风抗毒素生产工艺的发展现状及其临床使用的局限性，我国现行国家标准提高了对此类生物制品纯化工艺的要求，建议增加柱色谱、免疫吸附等纯化技术和完善酶解工艺。
[0003]可见，目前破伤风抗毒素的分离纯化方式存在无法同时满足高纯度、低成本、高回收率及工业化生产等问题，尤其在处理大量原料时，获得大量且高纯度的破伤风抗毒素的成本很高。
[0004]需要说明的是，在上述
技术介绍
部分公开的信息仅用于加强对本公开的背景的理解，因此可以包括不构成对本领域普通技术人员已知的现有技术的信息。
技术实现思路
[0005]本公开的目的在于提供一种破伤风抗毒素的纯化方法、层析填料及破伤风抗毒素，进而至少在一定程度上克服由于相关技术的限制和缺陷而导致的在处理大量原料时，获得大量且高纯度的破伤风抗毒素的成本很高的情况。
[0006]本公开的其他特性和优点将通过下面的详细描述变得显然，或部分地通过本公开的实践而习得。
[0007]根据本公开的第一方面，提供了一种破伤风抗毒素的纯化方法，包括：
[0008]使用装填有层析填料的层析柱对含有破伤风抗毒素的制品溶液进行层析处理，以对所述制品溶液进行纯化，得到破伤风抗毒素；其中，所述层析填料偶联有用于特异性结合破伤风抗体的亲和物质。
[0009]进一步的，步骤使用装填有层析填料的层析柱对含有破伤风抗毒素的制品溶液进行层析处理，以对所述制品溶液进行纯化包括：
[0010]将所述制品溶液上样于层析柱中，再使用平衡液处理层析柱；
[0011]使用洗脱溶剂处理经由平衡液处理后的层析柱，获得含有破伤风抗毒素的洗脱液，以完成对所述制品溶液的纯化。
[0012]进一步的，步骤将所述制品溶液上样于层析柱中，再使用平衡液处理层析柱中，层
析柱中的每毫升层析填料上样≤1000IU破伤风抗体效价的制品溶液；
[0013]所述制品溶液的上样的流速范围为0.5ml/min
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1.0ml/min；
[0014]所述平衡液的成分包括：磷酸氢二钠和磷酸二氢钠，所述平衡液的pH值范围为6.8
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7.2；所述平衡液的用量为3
‑
5倍层析柱的柱床体积；所述平衡液的流速范围为2.0ml/min
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5.0ml/min。
[0015]进一步的，所述洗脱溶剂的成分包括：醋酸；所述洗脱剂的pH值范围为2.0
‑
4.0；所述洗脱溶剂的流速范围为1.0ml/min
‑
4.0ml/min；所述洗脱溶剂的用量为2
‑
3倍层析柱的柱床体积。
[0016]进一步的，步骤使用装填有层析填料的层析柱对含有破伤风抗毒素的制品溶液进行层析处理之前，所述方法还包括：
[0017]对所述层析柱进行前处理；其中，所述前处理的方法包括：分别使用3
‑
5倍层析柱的柱床体积的水和平衡液对所述层析柱进行清洗，直至清洗后的流出液的pH范围为6.8
‑
7.2；其中，水和平衡液的流速范围均为2.0ml/min
‑
5.0ml/min。
[0018]进一步的，所述制品溶液的原料包括：马血浆过滤后物料、破伤风抗毒素半成品、破伤风抗毒素成品、人免疫球蛋白产品。
[0019]根据本公开的第二方面，提供了一种层析填料，用于装填上述的层析柱，所述层析填料的原料包括：CNBr
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Activated Sepharose 4FF介质、NHS
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Activated介质、Epoxy
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Activated介质和配体，所述配体为重组破伤风毒素c片段。
[0020]进一步的，所述层析填料的制作方法包括：
[0021]S1配体准备：将所述配体浓缩，然后用偶联缓冲液稀释，获得配体溶液；
[0022]S2介质准备：使用盐酸溶液分别清洗CNBr
‑
Activated Sepharose 4FF介质、NHS
‑
Activated介质、Epoxy
‑
Activated介质，获得活化介质；
[0023]S3配体偶联：活化介质与配体溶液混合，经反应获得偶联后的微球；
[0024]S4清洗和纯化：使用去离子水洗涤偶联后的微球；然后使用缓冲液A和缓冲液B交替清洗偶联后的微球；最后使用缓冲液C平衡偶联后的微球，获得所述层析填料。
[0025]进一步的，偶联缓冲液的成分包括：磷酸二氢钠和磷酸氢二钠，偶联缓冲液的pH值为7.5
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8.5；
[0026]在步骤S2介质准备中，所述盐酸溶液为1mmol/L的盐酸溶液；清洗次数为3
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5次；
[0027]在步骤S3配体偶联中，所述活化介质与所述配体溶液的体积比为：1:1
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1:100；反应的温度范围为4
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25℃；反应的pH值范围为7.5
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9.5；反应的时间为4
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16h；
[0028]在步骤S4清洗和纯化中，所述缓冲液A的成分包括：Tris和氯化钠，所述缓冲液A的pH值为8.0
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8.5；所述缓冲液B的成分包括：醋酸钠和氯化钠，所述缓冲液B的pH值为3.5
‑
4.5；所述缓冲液C的成分包括：磷酸二氢钠和磷酸氢二钠，所述缓冲液C的pH值为6.5
‑
7.5。
[0029]根据本公开的第三方面，提供了一种破伤风抗毒素，采用上述的破伤风抗毒素的纯化方法纯化获得。
[0030]本公开的一种破伤风抗毒素的纯化方法、层析填料及破伤风抗毒素，其中，纯化方法包括：使用装填有层析填料的层析柱对含有破伤风抗毒素的制品溶液进行层析处理，以对所述制品溶液进行纯化，得到破伤风抗毒素；其中，所述层析填料偶联有用于特异性结合破伤风抗体的亲和物质。本申请使用含有亲和物质的层析填料吸附蛋白溶液中的破伤风抗
毒素，并调整适宜的条件使破伤风抗毒本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种破伤风抗毒素的纯化方法，其特征在于，包括：使用装填有层析填料的层析柱对含有破伤风抗毒素的制品溶液进行层析处理，以对所述制品溶液进行纯化，得到破伤风抗毒素；其中，所述层析填料偶联有用于特异性结合破伤风抗体的亲和物质。2.根据权利要求1所述的破伤风抗毒素的纯化方法，其特征在于，步骤使用装填有层析填料的层析柱对含有破伤风抗毒素的制品溶液进行层析处理，以对所述制品溶液进行纯化包括：将所述制品溶液上样于层析柱中，再使用平衡液处理层析柱；使用洗脱溶剂处理经由平衡液处理后的层析柱，获得含有破伤风抗毒素的洗脱液，以完成对所述制品溶液的纯化。3.根据权利要求2所述的破伤风抗毒素的纯化方法，其特征在于，步骤将所述制品溶液上样于层析柱中，再使用平衡液处理层析柱中，层析柱中的每毫升层析填料上样≤1000IU破伤风抗体效价的制品溶液；所述制品溶液的上样的流速范围为0.5ml/min
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1.0ml/min；所述平衡液的成分包括：磷酸氢二钠和磷酸二氢钠，所述平衡液的pH值范围为6.8
‑
7.2；所述平衡液的用量为3
‑
5倍层析柱的柱床体积；所述平衡液的流速范围为2.0ml/min
‑
5.0ml/min。4.根据权利要求2所述的破伤风抗毒素的纯化方法，其特征在于，所述洗脱溶剂的成分包括：醋酸；所述洗脱剂的pH值范围为2.0
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4.0；所述洗脱溶剂的流速范围为0.5ml/min
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1.5ml/min；所述洗脱溶剂的用量为2
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3倍层析柱的柱床体积。5.根据权利要求1所述的破伤风抗毒素的纯化方法，其特征在于，步骤使用装填有层析填料的层析柱对含有破伤风抗毒素的制品溶液进行层析处理之前，所述方法还包括：对所述层析柱进行前处理；其中，所述前处理的方法包括：分别使用3
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5倍层析柱的柱床体积的水和平衡液对所述层析柱进行清洗，直至清洗后的流出液的pH范围为6.8
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7.2；其中，水和平衡液的流速范围均为：2.0ml/min
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5.0ml/min。6.根据权利要求1所述的破伤风抗毒素的纯化方法，其特征在于，所述制品溶液的原料包括：马血浆过滤后物料、破伤风抗毒素半成品、破伤风抗毒素成品、人免疫球...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵江峰，温涛，李艳霞，孟苗，秦奇鹏，张江凡，杨小静，
申请(专利权)人：西安麦博泰克生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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