慢病毒载体的生产制造技术

一种编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中慢病毒载体的RNA基因组中的主要剪接供体位点失活，并且其中主要剪接供体位点3'的隐蔽剪接供体位点失活。的隐蔽剪接供体位点失活。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】慢病毒载体的生产


[0001]本专利技术涉及在真核细胞中生产慢病毒载体。更具体地，本专利技术涉及载体基因组中的主要剪接供体位点和相邻的隐蔽剪接供体位点的失活。本专利技术提供了一种编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中慢病毒载体的RNA基因组中的主要剪接供体位点失活，并且其中位于主要剪接供体位点3'的隐蔽剪接供体位点失活。本专利技术还包括涉及这种核苷酸序列的方法和用途。

技术介绍

[0002]在过去的几十年中，在科学期刊和专利中详细记载了用于疫苗和人类基因治疗的病毒载体的开发和制造。使用工程改造的病毒递送转基因以达到治疗效果的用途十分广泛。基于RNA病毒和DNA病毒的现代基因治疗载体已经在越来越多的人类疾病适应症中显示出前景，其中RNA病毒例如为γ
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逆转录病毒和慢病毒(Muhlebach,M.D.et al.,2010,Retroviruses:Molecular Biology,Genomics and Pathogenesis,13:347
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370；Antoniou,M.N.,Skipper,K.A.&Anakok,O.,2013,Hum.Gene Ther.,24:363
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374)，而DNA病毒例如为腺病毒(Capasso,C.et al.,2014,Viruses,6:832
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855)和腺相关病毒(AAV)(Kotterman,M.A.&Schaffer,D.V.,2014,Nat.Rev.Genet.,15:445
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451)。这些方法包括针对血液病对患者细胞进行的离体修饰(Morgan,R.A.&Kakarla,S.,2014,Cancer J.,20:145
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150；Touzot,F.et al.,2014,Expert Opin.Biol.Ther.,14:789
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798)以及针对眼科(Balaggan,K.S.&Ali,R.R.,2012,Gene Ther.,19:145
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153)、心血管(Katz,M.G.et al.,2013,Hum.Gene Ther.,24:914
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927)、神经退行性疾病(Coune,P.G.,Schneider,B.L.&Aebischer,P.,2012,Cold Spring Harb.Perspect.Med.,4:a009431)进行的体内治疗、以及肿瘤疗法(Pazarentzos,E.&Mazarakis,N.D.,2014,Adv.Exp.Med Biol.,818:255
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280)。
[0003]随着这些方法在临床试验中的成功开始朝着监管批准和商业化方向发展，考虑向患者施用病毒载体时(例如在疫苗接种和基因治疗的情况下)所涉及的安全方面变得十分重要。
[0004]本领域持续需要具有改进的安全性的病毒载体。

技术实现思路

[0005]本专利技术基于在慢病毒载体基因组的包装区域中的主要剪接供体位点和相邻的隐蔽剪接供体位点的失活。慢病毒载体基因组中存在的主要剪接供体位点(MSD)通常嵌入含有高度结构化RNA的包装区域内，朝向RNA的5'区域。
[0006]逆转录病毒基因组内的剪接供体位点已被证明对生产细胞内的病毒RNA(vRNA)稳定性很重要。然而，本专利技术人表明，慢病毒载体基因组表达盒内的MSD的活性可能是高度混杂的，并且可以非常有效地剪接内部表达盒内的强或甚至弱的隐蔽剪接受体位点，这些位点通常位于下游>1350bp处。令人惊讶的是，根据内部序列，多达95％的源自驱动vRNA生产的外部启动子的可检测细胞质mRNA被剪接。
[0007]对于高效的载体生产，未剪接的可包装vRNA是最理想的产物，这种载体的组分通常是瞬时和稳定转染载体生产设置的限制因素。此外，如果这种异常剪接的mRNA编码目的转基因(例如剪接到内部启动子
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utr序列中)，则该mRNA将被输出并能够在载体生产过程中被有效翻译；这将独立于内部启动子是否是弱/沉默(组织特异性)启动子而发生。
[0008]此外，当来自上游细胞启动子的通读转录发生时(慢病毒载体靶向活性转录位点)，其他人已证明了在转导(患者)细胞中递送的载体骨架中存在MSD可被剪接机制利用，导致出现具有细胞外显子的潜在异常剪接产物。因此，有几个原因表明为什么需要对慢病毒载体基因组中的MSD位点进行功能性突变。
[0009]其他人已经生产了在MSD位点内含有突变的早期慢病毒载体，但这些载体含有固有的U3启动子以驱动vRNA的转录，因此依赖于以反式提供的tat进行反式激活。第三代慢病毒载体用异源启动子元件替换了U3启动子，并且不需要tat进行转录。监管机构将第三代载体的U3/tat独立性视为安全性的重要进步，因为tat是细胞基因的反式激活因子，并且可以在肿瘤发生中发挥作用。
[0010]在一个方面中，本专利技术提供了编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中慢病毒载体的RNA基因组中的主要剪接供体位点失活，并且位于主要剪接供体位点3'的隐蔽剪接供体位点失活。
[0011]在本专利技术实施例中证明，慢病毒载体的RNA基因组中的主要剪接供体位点和位于主要剪接供体位点3'的隐蔽剪接供体位点的失活提供了对单独突变的改进。还如在本专利技术实施例中所证明的，本专利技术有助于减少靶细胞中的整合慢病毒载体中的转录通读，例如减少至少2倍。
[0012]在一个方面中，根据本专利技术的核苷酸序列用于不依赖U3或tat的慢病毒载体系统。在一个方面中，慢病毒载体系统可以是如本文所述的第三代慢病毒载体系统。
[0013]隐蔽剪接供体位点是位于主要剪接供体位点3'的第一个隐蔽剪接供体位点或序列。在一个方面中，隐蔽剪接供体位点或序列在主要剪接供体位点的6个核苷酸内。主要剪接供体位点和隐蔽剪接供体位点可能会发生突变或被删除。
[0014]在一个方面中，本专利技术提供了编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中该核苷酸序列在剪接位点失活前包括如SEQ ID NO:1、3、4、9、10和/或13中任一个所示的序列。核苷酸序列可包括相对于SEQ ID NO:1、3、4、9、10和/或13中任一个所示的序列具有突变或删除的序列。在一个方面中，序列包括SEQ ID NO:13。
[0015]在一个方面中，核苷酸序列包含失活的主要剪接供体位点，否则该核苷酸序列将在主要剪接供体区域(SEQ ID NO:13)的核苷酸1的紧邻上游具有切割位点。
[0016]在一个方面中，核苷酸序列包含失活的主要剪接供体位点和失活的隐蔽剪接供体位点，否则该核苷酸序列将在主要剪接供体区域(SEQ ID NO:13)的核苷酸1的紧邻上游、以及对应于核苷酸的核苷酸4和5之间具有切割位点。
[0017]在一个方面中，核苷酸序列包含失活的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中所述慢病毒载体的RNA基因组中的主要剪接供体位点失活，并且其中位于所述主要剪接供体位点3'的隐蔽剪接供体位点失活。2.根据权利要求1所述的编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中所述慢病毒载体是第三代慢病毒载体。3.一种编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中所述慢病毒载体的RNA基因组中的主要剪接供体位点失活，并且其中位于所述主要剪接供体位点3'的隐蔽剪接供体位点失活，其中所述核苷酸序列用于不依赖tat的慢病毒载体。4.一种编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中所述慢病毒载体的RNA基因组中的主要剪接供体位点失活，并且其中位于所述主要剪接供体位点3'的隐蔽剪接供体位点失活，其中所述核苷酸序列是在不存在tat的情况下产生的。5.一种编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中所述慢病毒载体的RNA基因组中的主要剪接供体位点失活，并且其中位于所述主要剪接供体位点3'的隐蔽剪接供体位点失活，其中所述核苷酸序列独立于tat转录。6.一种编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中所述慢病毒载体的RNA基因组中的主要剪接供体位点失活，并且其中位于所述主要剪接供体位点3'的隐蔽剪接供体位点失活，其中所述核苷酸序列用于不依赖U3的慢病毒载体。7.一种编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中所述慢病毒载体的RNA基因组中的主要剪接供体位点失活，并且其中位于所述主要剪接供体位点3'的隐蔽剪接供体位点失活，其中所述核苷酸序列独立于U3启动子转录。8.一种编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中所述慢病毒载体的RNA基因组中的主要剪接供体位点失活，并且其中位于所述主要剪接供体位点3'的隐蔽剪接供体位点失活，其中所述核苷酸序列由异源启动子转录。9.根据前述权利要求中任一项所述的编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中所述隐蔽剪接供体位点是位于所述主要剪接供体位点3'的第一个隐蔽剪接供体位点。10.根据前述权利要求中任一项所述的编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中所述隐蔽剪接供体位点在所述主要剪接供体位点的6个核苷酸内。11.根据前述权利要求中任一项所述的编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中所述主要剪接供体位点和所述隐蔽剪接供体位点具有突变或被删除。12.根据前述权利要求中任一项所述的编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中在所述剪接位点失活之前的核苷酸序列包含如SEQ ID NO:1、3、4、9、10和/或13中任一者所示的序列。13.根据前述权利要求中任一项所述的编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含相对于如SEQ ID NO:1、3、4、9、10和/或13中任一者所示的序列具有突变或被删除的序列。14.根据前述权利要求中任一项所述的编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含失活的主要剪接供体位点，否则所述核苷酸序列将在对应于SEQ ID NO:1的核苷酸13和14的核苷酸之间具有切割位点。15.根据前述权利要求中任一项所述的编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其
中在所述主要剪接供体位点失活之前的核苷酸序列包含如SEQ ID NO:4所示的序列。16.根据前述权利要求中任一项所述的编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中在所述隐蔽剪接供体位点失活之前的核苷酸序列包含如SEQ ID NO:10所示的序列。17.根据前述权利要求中任一项所述的编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含失活的隐蔽剪接供体位点，否则所述核苷酸序列将在对应于SEQ ID NO:1的核苷酸17和18的核苷酸之间具有切割位点。18.根据前述权利要求中任一项所述的编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含如SEQ ID NO:2、5、6、7、8、11、12和/或14中任一者所示的序列。19.根据前述权利要求中任一项所述的编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列不包含如SEQ ID NO:9所示的序列。20.根据前述权利要求中任一项所述的编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中来自所述慢病毒载体的RNA基因组的主要剪接供体位点和隐蔽剪接供体位点的剪接活性被抑制或被消除。21.根据前述权利要求中任一项所述的编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中在转染细胞或转导细胞中，来自所述慢病毒载体的RNA基因组的主要剪接供体位点和隐蔽剪接供体位点的剪接活性被抑制或被消除。22.根据前述权利要求中任一项所述的编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列进一步包含位于包装序列的SL4环内的隐蔽剪接供体位点中的突变。23.根据权利要求22所述的编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中位于所述包装序列的SL4环内的所述隐蔽剪接供体位点中的GT二核苷酸突变为GC。24.根据前述权利要求中任一项所述的编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列还包含目的核苷酸。25.根据权利要求24所述的编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中所述目的核苷酸产生治疗效果。26.根据前述权利要求中任一项所述的编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列是载体转基因表达盒。27.根据前述权利要求中任一项所述的编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列进一步包含编码经修饰的U1snRNA的核苷酸序列，其中所述经修饰的U1 snRNA已被修饰以结合MSD突变的慢病毒载体基因组的包装区域内的核苷酸序列。28.根据权利要求27所述的编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列，其中所述编码慢病毒载体的RNA基因组的核苷酸序列能够与编码经修饰的U1 snRNA的核苷酸序列连接。29.根据前述权利要求中任一项所述的编码慢病毒载体的RNA基因组的...

【专利技术属性】
技术研发人员：丹尼尔，
申请(专利权)人：牛津生物医学英国有限公司，
类型：发明
国别省市：