碳酸钙在提高普鲁兰多糖产量中的应用及应用方法技术

本发明专利技术属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种在高渗培养基中加入轻质碳酸钙实现高效发酵产普鲁兰多糖的方法。碳酸钙，尤其是轻质碳酸钙在发酵生产普鲁兰多糖中的应用，是本发明专利技术所要重点保护的内容。具体的应用方法是，将轻质碳酸钙与碳源、氮源、无机盐共同加入到培养基中，利用轻质碳酸钙吸收菌体外排的酸性物质的能力，促进出芽短梗霉NCPS007发酵生产普鲁兰多糖，从而提高普鲁兰多糖的产量。本发明专利技术的有益效果在于，利用轻质CaCO3，菌株出芽短梗霉NCPS007可以在高浓度果糖培养基中发酵，转化率具有竞争力，不仅大大提高了普鲁兰多糖产量，而且降低了生产成本。而且降低了生产成本。而且降低了生产成本。

【技术实现步骤摘要】
碳酸钙在提高普鲁兰多糖产量中的应用及应用方法


[0001]本专利技术属于微生物发酵
，具体涉及一种在高渗培养基中加入轻质碳酸钙以实现高效发酵生产普鲁兰多糖的方法。

技术介绍

[0002]普鲁兰糖是由出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)分泌的胞外水溶性多糖，鉴于其独特的结构特征，具有高水溶性、良好的成膜性、阻氧性、生物相容性及可降解等特性，被广泛应用于食品工业、农产品保鲜等领域。
[0003]普鲁兰糖极具应用价值，但生产成本较高，而且其产糖机制尚未得到完全阐明，大大限制了它的广泛应用。
[0004]目前已报道的大多数普鲁兰糖生产菌株在碳源浓度高于50g/L培养基中发酵培养时，普鲁兰糖的合成会受到抑制，这可能是参与普鲁兰糖合成关键酶—α
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磷酸葡糖变位酶、尿苷二磷酸焦磷酸化酶(UDPG
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焦磷酸化酶)、葡糖基转移酶的活性受到抑制所造成的。
[0005]近年来，可利用高浓度蔗糖或葡萄糖作为碳源高效合成普鲁兰糖的耐高渗菌株相继被报道，而碳源浓度的高低直接影响着普鲁兰糖产量的高低，因此，寻找耐高渗的普鲁兰糖生产菌株是提高普鲁兰糖产量的有效手段。但是这些已报道的耐高渗菌株高效合成普鲁兰糖其产量并不高，需要进一步的对这些技术进行改进，以期提高普鲁兰糖的产量。
[0006]此外，文献报道，出芽短梗霉分泌普鲁兰的同时普遍会同时生成黑色素，给后期多糖的分离纯化造成了不利的影响，加大分离纯化的工作成本。(Liu et al.,2021)(Liu,F.,Zhang,J.H.,Zhang,L.J.,Diao,M.Q.,Ling,P. X.,&Wang,F.S.(2021).Correlation between the synthesis of pullulan andmelanin in Aureobasidium pullulans.International Journal of Biological Macromolecules, 177,252
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260.)。
[0007]因此，寻找不产黑色素的普鲁兰糖高产菌株以及通过优化其发酵条件以进一步提高普鲁兰糖产量，具有重要的实际应用价值，是有效降低其生产成本的重要手段。

技术实现思路

[0008]为了解决上述的技术问题，本专利技术提供了一种利用轻质碳酸钙作为出芽短梗霉NCPS007发酵过程中的其中一种培养基原料，促进出芽短梗霉 NCPS007发酵生产普鲁兰多糖从而提高普鲁兰多糖产量的方法。本专利技术中首次提出将轻质碳酸钙应用于提高普鲁兰生产菌株的普鲁兰产量中，从而可使得普鲁兰的生产成本大大降低。
[0009]将碳酸钙应用在发酵生产普鲁兰多糖中，具体是将碳酸钙应用于出芽短梗霉NCPS007发酵生产普鲁兰多糖的培养基中，是本专利技术所要重点保护的内容。出芽短梗霉NCPS007在高渗培养条件下，利用轻质碳酸钙作为其培养基中的一种原料，再利用其它的特定的原料比如以果糖为碳源、以豆粕水解物为氮源、以氯化钾、硫酸铵、氯化钠、硫酸镁为无机盐，可以极大的提高普鲁兰多糖的产量。
[0010]上述的出芽短梗霉NCPS007，其保藏编号为：CCTCC NO：M20221271，保藏中心地址
为：中国武汉武汉大学。在实验过程中，本专利技术人对上述的菌株曾命名为NCPS2016，待保藏时将其命名为NCPS007；其拉丁文名称为：Aureobasidium pullulans NCPS007，是专利技术人于2022年8月12日保藏在中国典型培养物保藏中心的菌株。
[0011]上述的碳酸钙为轻质碳酸钙，更具体来说是食品级的轻质碳酸钙；在培养基中，碳酸钙浓度为10～20g/L。
[0012]上述的发酵培养基是含有180～220g/L碳源的高渗培养基。
[0013]优选的，在发酵过程中，保持培养基中碳源的浓度为180～220g/L，氮源浓度为5～12g/L，无机盐浓度为6～15g/L，轻质碳酸钙为10～20g/L；
[0014]上述的碳源为果糖，氮源为豆粕水解液；无机盐为硫酸铵、氯化钠、氯化钾、硫酸镁；
[0015]豆粕水解液的制备方法如下：将63g豆粕与0.25M HCl(123mL)在 121℃下酸水解30min，冷却至常温，定容至1L制备豆粕水解物。
[0016]上述的培养基中，碳源浓度为200g/L，氮源浓度为7.89g/L，无机盐浓度为11.35g/L，轻质碳酸钙浓度为15g/L；所述的碳源为果糖，所述的氮源为豆粕水解液；
[0017]无机盐中，硫酸铵0.4g/L、氯化钠为3.45g/L、氯化钾为7.5g/L、硫酸镁2g/L。
[0018]利用碳酸钙提高普鲁兰多糖产量的方法，包括以下的步骤：
[0019](1)培养出芽短梗霉菌NCPS007，获得种子培养物；
[0020](2)在摇瓶中加入培养基，接种步骤(1)中的种子培养物，发酵生产普鲁兰多糖；
[0021]或者是，步骤(2)在发酵罐中加入培养基，取步骤(1)中的种子培养物，转移到发酵罐中发酵培养，离心，获得含有普鲁兰多糖的上清液；
[0022]步骤(2)中，所述的培养基中含有：碳源、氮源、无机盐、轻质碳酸钙；培养基中碳源的浓度为180～220g/L，氮源浓度为5～12g/L，无机盐浓度为6～15g/L，轻质碳酸钙为10～20g/L。
[0023]更具体的，上述的方法中，步骤(1)将野生型菌株出芽短梗霉菌NCPS007 在28℃下在含有蛋白胨20g/L、酵母提取物10g/L、葡萄糖20g/L和琼脂2 g/L的YPD琼脂培养基中生长2d，然后，将单个菌落从琼脂平板转移到含有100mL种子培养基的500mL摇瓶中，培养基由葡萄糖20g/L、K2HPO
4 6.6 g/L、NaCl 1g/L、(NH4)2SO
4 0.6g/L和MgSO
4 0.2g/L组成，将培养物在28℃和220rpm的振荡器上好氧培养24h，将菌株储存在1.5mL Eppendorf管中，在
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80℃下用体积浓度为20％的甘油保存。
[0024]若是将步骤(1)中的种子接种物在摇瓶中培养，其具体的培养条件如下：步骤(2)在摇瓶中加入培养基，接种步骤(1)中的种子培养物，准备如下的培养基，200g/L果糖、SMHs为7.89g/L、硫酸铵0.4g/L、氯化钠为3.45g/L、KCl为7.5g/L、硫酸镁2g/L、轻质碳酸钙为15g/L；
[0025]将4mL步骤(1)中的种子接种物接种到含有80mL发酵培养基的500 mL锥形瓶中用于生产普鲁兰多糖，并在28℃和220rpm的旋转振荡器上发酵96h。
[0026]若是将步骤(1)中的种子接种物在发酵罐中培养，其具体的培养条件如下：在发酵罐中加入如下的培养基，果糖200g/L、SMHs为7.89g/L、硫酸铵0.4g/L、氯化钠为3.45g/L、KCl为7.5g本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.碳酸钙在提高普鲁兰多糖产量中的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，利用出芽短梗霉NCPS007发酵生产普鲁兰多糖，所述的碳酸钙用于出芽短梗霉NCPS007发酵培养基中。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的碳酸钙为轻质碳酸钙，在培养基中，所述的碳酸钙浓度为10～20 g/L。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，在发酵生产普鲁兰多糖的过程中，所述的轻质碳酸钙为食品级的轻质碳酸钙；所述的发酵培养基是含有180～220 g/L碳源的高渗培养基。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，在发酵过程中，保持培养基中碳源的浓度为180～220 g/L，氮源浓度为5～12 g/L，无机盐浓度为6～15 g/L，轻质碳酸钙为10～20 g/L；所述的碳源为果糖，所述的氮源为豆粕水解液；无机盐为硫酸铵、氯化钠、氯化钾、硫酸镁；豆粕水解液的制备方法如下：将63 g豆粕与123 mL 0.25 M HCl 溶液在121℃下酸水解30 min，冷却至常温，定容至1L，获得豆粕水解物。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的培养基中，碳源浓度为200 g/L，氮源浓度为7.89 g/L，无机盐浓度为13.35 g/L，轻质碳酸钙浓度为15 g/L；无机盐中，硫酸铵为0.4 g/L，氯化钠为3.45 g/L，氯化钾为7.5 g/L，硫酸镁为2 g/L。7.利用碳酸钙提高普鲁兰多糖产量的方法，包括以下的步骤：（1）培养出芽短梗霉菌NCPS007，获得种子培养物；（2）在摇瓶中加入培养基，接种步骤（1）中的种子培养物，发酵生产普鲁兰多糖；或者是，步骤（2）在发酵罐中加入培养基，取步骤（1）中的种子培养物，转移到发酵罐中发酵培养，离心，获得含有普鲁兰多糖的上清液；步骤（2）中，所述的培养基中含有：碳源、氮源、无机盐、轻质碳酸钙；培养基中碳源的浓度为180～220 g/L，氮源浓度为5～12 g/L，无机盐浓度为6～15 g/L，轻质碳酸钙为10～20 g/L；所述的碳源为果...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨金玉，陈蕾蕾，赵双枝，周庆新，张彦昊，裘纪莹，王军华，辛雪，杨晓宇，姜潇潇，祝清俊，
申请(专利权)人：山东省农业科学院，
类型：发明
国别省市：