用于同型半胱氨酸循环酶法检测的酶液保护剂及制备方法技术

本发明专利技术提供一种用于同型半胱氨酸循环酶法检测的酶液保护剂及制备方法。本发明专利技术保护剂由50

【技术实现步骤摘要】
用于同型半胱氨酸循环酶法检测的酶液保护剂及制备方法


[0001]本专利技术属于生化诊断试剂
，具体地说，涉及一种用于同型半胱氨酸循环酶法检测的酶液保护剂及制备方法。

技术介绍

[0002]同型半胱氨酸(homocysteine，HCY)又称高半胱氨酸，为一种含巯基的氨基酸，主要来源于饮食摄取的甲硫氨酸，是人体内甲硫氨酸和半胱氨酸代谢及甲基活化过程中的重要中间产物，其本身并不参加蛋白质的合成。在细胞内，人体摄取的甲硫氨酸与ATP由甲硫氨酸腺苷基转移酶(MAT)催化生成S
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腺苷甲硫氨酸(SAM)，SAM为活化的甲基供体，参与多种转甲基生理反应，生成S
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腺苷同型半胱氨酸(SAH)，SAH经水解脱腺苷生成同型半胱氨酸(HCY)。约一半的Hcy由甲基四氢叶酸提供一碳单位在甲硫氨酸合成酶(MS)的作用下，生成甲硫氨酸，完成甲硫氨酸到甲硫氨酸的循环。另一半的Hcy通过转硫基途径代谢，Hcy与丝氨酸在胱硫醚β合成酶(CBS)作用下形成胱硫醚，在胱硫醚裂解酶的作用下形成半胱氨酸。
[0003]HCY在人体血浆中以两种形式存在，氧化型同型半胱氨酸和还原型同型半胱氨酸。氧化型是同型半胱氨酸在血浆中的主要存在形式，以二硫化物形式或与蛋白质结合形式存在；还原型同型半胱氨酸中游离的巯基具有很高的活性，能诱使人体内氧自由基爆发。正常情况下，血液中同型半胱氨酸在体内能被分解代谢，浓度维持在较低水平。但原发性和继发性疾病将导致血同型半胱氨酸浓度升高，形成高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia，HHCY)。1969年Mccully从遗传性同型半胱氨酸尿症死亡儿童尸检中发现,其体循环内存在广泛的动脉血栓形成及动脉粥样硬化(AS)的病理表现，由此提出HHCY可导致动脉粥样硬化性血管性疾病的假说。多年的基础和临床研究已充分证实HCY可以直接或间接导致血管内皮细胞损伤，促进血管平滑肌细胞增殖，影响低密度脂蛋白的氧化，增强血小板功能，引起斑块，导致心血管、动脉粥样硬化和中风等疾病；HHCY会导致人体产生认知功能障碍，严重的会导致产生阿尔茨海默氏病，精神分裂症；HHCY也增加了老年人群骨折比例。同时叶酸、维生素B6、B12的缺乏将导致人体HCY升高。因此HCY已成为动脉粥样硬化、冠心病和静脉血栓等心脑血管疾病的重要临床和预警指标，也是精神性疾病、老年病、维生素缺乏等病症诊断的重要补充指标。
[0004]HCY测定方法主要有高效液相色谱法(HPLC法)、气相色谱
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质谱法(GC
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MS法)、酶免疫检测法(ELA法)、荧光偏振免疫检测法(FPLA法)和循环酶法。色谱法具有很高的准确度和稳定性，然而，对标本的处理和操作人员、设备维护要求较高，通常作为同型半胱氨酸的参考方法，而不能用于常规样本的检测；酶联免疫法的灵敏度高、特异性强，但是操作繁琐，精密度差，耗费时间长，不适合大量样本的检测；荧光偏振免疫检测法，需要配备专用的检测仪器，单次检测成本较高。因此可适用于大型生化分析仪、操作简便，精密度好的HCY循环酶法已成为临床检测的主要技术。
[0005]目前循环酶法包括水解酶法和胱硫醚法两种方法。但胱硫醚法因不能消除正常代谢的β
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胱硫醚，尤其对于肾脏疾病患者会产生特别高的β
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胱硫醚，从而导致检测结果的不
准确。而水解酶法特异性高，抗干扰能力强，能消除体内代谢β
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胱硫醚，检测结果更为准确。因此国内外研发出了多款HCY水解酶检测试剂盒。但由于水解酶循环酶法试剂盒中需要用到S
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腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHase)、Hcy甲基转移酶(HMTase)、腺苷脱氨酶(ADA)和谷氨酸脱氢酶(GLDH)混合酶液，而这4种酶普遍热稳定性不高，且SAHase、GLADH受铜等金属离子强抑制，ADA为巯基酶，GLADH中活性中心Cys的巯基至关重要，巯基存在不稳定性谁空气暴露时间延长、温度升高极易氧化成二硫键，同时一般试剂盒常用的抗巯基氧化的抗坏血酸对该GLADH有较强的抑制作用。混合酶的这些特征导致目前试剂盒在室温暴露使用时(生化分析仪的使用特点)，活性不稳定，表现为试剂盒在使用后期测值偏低，尤其是高值样本(有临床指导意义的样本)。这严重制约了试剂盒的有效利用，增加了检测成本，降低了生化分析仪的使用效率，甚至会对病例的临床指标给出错误的信息导致漏诊。因此研发HCY循环酶法检测试剂盒酶液保护剂，以延长其使用寿命，提高其有效期内测值的可靠性十分必要和迫切。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种用于同型半胱氨酸循环酶法检测的酶液保护剂及制备方法。
[0007]为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种用于同型半胱氨酸循环酶法检测的酶液保护剂，所述保护剂由50
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200mM pH9.0HEPES、10
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20v/v％聚丙二醇400、10
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20m/v％山梨醇、0.1
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0.2v/v％Triton X
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100、10
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20mM二硫苏糖醇、5
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10mM EDTA和0.1
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0.2m/v％NaN3组成。
[0008]所述保护剂的工作浓度为：50mM pH9.0HEPES、10v/v％聚丙二醇400、5m/v％山梨醇、0.05v/v％Triton X
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100、10mM二硫苏糖醇、2.5mM EDTA和0.05m/v％NaN3。
[0009]上述酶液保护剂配方及工作浓度为大量优化实验的结果，能最大程度地维持SAHase、HMTase、ADA和GLDH四种酶的活性，且与中生北控生物科技股份有限公司生产的同型半胱氨酸(双试剂)循环酶法检测试剂盒配合使用效果最佳。
[0010]第二方面，本专利技术提供所述保护剂的制备方法，包括以下步骤：
[0011](1)将无离子水和聚丙二醇400按1:1体积比混合，配制成50％浓度的聚丙二醇母液，记为溶液A；
[0012](2)称取HEPES，用无离子水溶解，调pH至9.0，配制成200mM HEPES缓冲液；按终浓度分别为20m/v％、20mM、10mM和0.2m/v％的比例，称取山梨醇、二硫苏糖醇、EDTA和NaN3，依次加入200mM HEPES缓冲液中混匀，得到混合液；然后按终浓度为0.2v/v％的比例量取Triton X
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100，加入所述混合液中，配制成溶液B；
[0013](3)将所述溶液A和B按4:5体积比混合，调pH至9.0，无离子水定容至预配制体积，用0.45μm滤膜过滤，得到pH9.0的100mM HEPES缓冲液、20％聚丙二醇400、10％山梨醇、0.1％Triton X
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100、10mM二硫苏糖醇、5mM EDTA和0.1％ NaN3组成的混合酶液保护剂；使用时，用无离子水稀释1倍至工作浓度。<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于同型半胱氨酸循环酶法检测的酶液保护剂，其特征在于，所述保护剂由50
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200mM pH9.0 HEPES、10
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20v/v％聚丙二醇400、10
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20m/v％山梨醇、0.1
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0.2v/v％Triton X
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100、10
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20mM二硫苏糖醇、5
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10mM EDTA和0.1
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0.2m/v％NaN3组成。2.根据权利要求1所述的保护剂，其特征在于，所述保护剂的工作浓度为：50mM pH9.0 HEPES、10v/v％聚丙二醇400、5m/v％山梨醇、0.05v/v％Triton X
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100、10mM二硫苏糖醇、2.5mM EDTA和0.05m/v％NaN3。3.权利要求2所述保护剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将无离...

【专利技术属性】
技术研发人员：邱枫，张勇，
申请(专利权)人：中生北控生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：