一种微孢子虫荧光染色标记方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种微孢子虫荧光染色标记方法及应用，属于荧光染色领域，所述方法包括以下步骤：将微孢子虫孢子或胞内发育时期微孢子虫采用染色液染色后使用荧光显微镜观察；所述染色液为含有直接黄96或直接红28的溶液。本发明专利技术的微孢子虫荧光染色标记方法在极短时间内便可将微孢子虫标记为绿色或红色，与DAPI标记的蓝色细胞核区别开，便于分析。与CFW相比，使用该染料极大的拓展了微孢子虫的荧光标记范围，此外该染料还具有价格低廉、容易获得、质量可靠本且具有极高的实验重现性等优势。使用宽场荧光显微镜及激光共聚焦显微镜对哺乳动物微孢子虫、昆虫微孢子虫和水生微孢子虫均可得到良好的成像检测效果。得到良好的成像检测效果。得到良好的成像检测效果。

【技术实现步骤摘要】
一种微孢子虫荧光染色标记方法及应用


[0001]本专利技术属于荧光染色领域，具体涉及一种微孢子虫荧光染色标记方法及应用。

技术介绍

[0002]公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
[0003]微孢子虫(microsporidia)是一种专性细胞内寄生的机会性病原体，具有极其广泛的宿主范围，可以感染包括无脊椎动物以及脊椎动物等所有的动物，例如人类、兔、鱼、蟹、家蚕等均是其天然宿主。在微孢子虫的鉴定及其与宿主相互作用的研究中，微孢子虫的标记具有重要意义。常用微孢子虫标记方法包括免疫学方法，荧光染色等，其中免疫学方法常用于标记细胞内微孢子虫及成熟孢子，该方法需要对已经鉴定的微孢子虫孢壁蛋白进行体外表达，通过免疫动物获得的相应抗体作为一抗与荧光标记二抗特异性结合实现孢子标记。该方法准确度高，但步骤繁琐，周期长，耗时久。同时该方法涉及基因工程技术，包括表达载体的构建、蛋白的表达及纯化、对动物的多次免疫等过程，对操作者的技术要求较高。此外经常遇到蛋白表达失败，免疫无效、抗体降解等问题。
[0004]微孢子虫另一种常用的标记方法是荧光染色，微孢子虫具有高电子密度的孢外壁与低电子密度的孢内壁，其中孢内壁主要成分是α
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几丁质，因此可使用荧光增白剂对微孢子虫进行荧光检测。卡尔科夫卢尔荧光增白剂(CFW)也被称为荧光增白剂28，被广泛用于对细菌、真菌、藻类、高等植物和昆虫细胞壁的染色。CFW最大激发波长为349nm，最大发射波长为432nm，是目前最常用的对微孢子虫进行荧光标记的染料，与荧光显微镜结合使用时可发出明亮的蓝色荧光，被广泛应用于病理材料、粪便等样本中微孢子虫的检出及科学研究中。但使用CFW对微孢子虫染色仍存在一些不足：首先，应用该染料与4',6
‑
二脒基
‑2‑
苯基吲哚(DAPI)对样本联合染色时均产生蓝色荧光，对样本分析造成不便；其次，CFW的荧光寿命短，只能在极短的时间内产生强烈荧光，随后荧光强度迅速降低；最后，CFW的价格高昂，使用其对微孢子虫进行染色时成本高。
[0005]因此，建立一种能与DAPI蓝色荧光区别开且能够快速、方便且经济地对微孢子虫进行荧光标记的方法具有重要意义和应用价值。

技术实现思路

[0006]为了解决现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种微孢子虫荧光染色标记方法及应用，本专利技术提供的方法能与DAPI蓝色荧光区别开，且能够快速、方便且经济地对微孢子虫进行荧光标记。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术的技术方案为：
[0008]一方面，一种微孢子虫荧光染色标记方法，所述方法包括以下步骤：
[0009]将微孢子虫孢子或胞内发育时期微孢子虫采用染色液染色后使用荧光显微镜观
察；
[0010]所述染色液为含有直接黄96的溶液，或含有直接红28的溶液。
[0011]本专利技术的微孢子虫荧光染色标记方法，采用含有直接黄96的染色液进行染色时，将微孢子虫标记为绿色，采用含有直接红28的染色液进行染色时，将微孢子虫标记为红色，与DAPI标记的蓝色细胞核明显区别开，便于分析，扩展了微孢子虫标记染料的应用范围。
[0012]优选的，所述孢子为成熟微孢子虫孢子。
[0013]优选的，微孢子虫孢子染色的具体步骤为：将成熟孢子浸入染色液后使用荧光显微镜观察，或将孢子固定后，使用染色液染色后使用荧光显微镜观察。
[0014]进一步优选的，所述固定为使用固定剂对孢子进行固定，优选的，固定剂为多聚甲醛。
[0015]优选的，胞内发育时期微孢子虫染色的具体步骤为：将感染微孢子虫的细胞铺于细胞爬片上，使用固定剂固定，染色液染色后使用荧光显微镜观察。
[0016]进一步优选的，所述固定剂为多聚甲醛。
[0017]优选的，所述染色液为染色母液稀释得到的，所述染色母液的制备方法为：将直接黄96或直接红28溶解于缓冲液或水中，涡旋或吹打混匀，即得。
[0018]进一步优选的，所述缓冲液包括PBS缓冲液、PBST缓冲液、Tris
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HCl缓冲液等。
[0019]优选的，所述染色液中直接黄96的浓度为5～15μg/ml，优选为10μg/ml；或，所述染色液中直接红28的浓度为50～150μg/ml，优选为100μg/ml。其中，本专利技术中使用的染色液可提前配制母液，使用时稀释到所需浓度使用即可。
[0020]优选的，所述染色液为含有直接黄96的溶液时，染色时间为：0min<染色时间≤2min，优选为1～2min；
[0021]或，染色液为含有直接红28的溶液时，染色时间为：0min<染色时间≤10min，优选为5～10min。
[0022]本专利技术所用染色液染色时间短，使用含有直接黄96溶液对游离微孢子虫孢子及细胞内孢子染色时，只需染色1
‑
2min即可；使用含有直接红28溶液对游离微孢子虫孢子及细胞内孢子染色时，只需染色5
‑
10min即可。染色后使用不含染料的缓冲液洗涤两次，每次1
‑
2min。对于较厚样本可适度增加染色时间，并增加洗涤时间。
[0023]本专利技术的染色方法，染色液在使用时浓度可适当调整，当细胞被轻微染色时可适当降低染色液的浓度，或降低染色时间并增加洗涤次数；相反的，当染色液浓度过低导致无法提供良好成像效果时，可适当增加染色液的浓度，或增长染色时间并降低洗涤次数。
[0024]另一方面，上述微孢子虫荧光染色标记方法在观察微孢子虫孢子在游离或胞内发育时期染色标记中的应用。
[0025]本专利技术的有益效果为：
[0026]本专利技术的微孢子虫荧光染色标记方法，通过直接将染色液应用于微孢子虫孢子或被微孢子虫感染细胞中孢子的染色，只需极短的时间即可对微孢子虫进行选择性标记，将微孢子虫标记为绿色或红色，与DAPI标记的蓝色细胞核区别开，便于分析。与目前唯一可用的将微孢子虫进行蓝色标记的卡尔科夫卢尔荧光增白剂(CFW)相比，使用直接黄96或直接红28染料极大的拓展了微孢子虫的荧光标记范围，此外本专利技术所用染料还具有价格低廉、容易获得、质量可靠且具有极高的实验重现性等诸多优势，其中每毫升染色液中直接黄96
或直接红28花费不足一分钱，同时直接黄96染色液可在室温条件下避光保存一年以上，性质稳定，使用方便。本专利技术使用宽场荧光显微镜及激光共聚焦显微镜对哺乳动物微孢子虫、昆虫微孢子虫和水生微孢子虫均可得到良好的成像检测效果。
[0027]本专利技术的微孢子虫荧光染色标记方法存在染色时间短，操作方便，步骤简单，不需要专业人员操作等优点，无复杂操作流程，大大缩短实验周期值。
[0028]本专利技术的方法能够快速、准确地对微孢子虫进行荧光标记，在微孢子虫的鉴定及其与宿主相互作用的研究中，具有重要意义和应用价值。
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种微孢子虫荧光染色标记方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：将微孢子虫孢子或胞内发育时期微孢子虫采用染色液染色后使用荧光显微镜观察；所述染色液为含有直接黄96的溶液，或含有直接红28的溶液。2.根据权利要求1所述微孢子虫荧光染色标记方法，其特征在于，所述孢子为成熟微孢子虫孢子；优选的，微孢子虫孢子染色的具体步骤为：将成熟孢子浸入染色液后使用荧光显微镜观察，或将孢子固定后，使用染色液染色后使用荧光显微镜观察。3.根据权利要求2所述微孢子虫荧光染色标记方法，其特征在于，所述固定为使用固定剂对孢子进行固定，优选的，固定剂为多聚甲醛。4.根据权利要求1所述微孢子虫荧光染色标记方法，其特征在于，胞内发育时期微孢子虫染色的具体步骤为：将感染微孢子虫的细胞铺于细胞爬片上，使用固定剂固定，染色液染色后使用荧光显微镜观察。5.根据权利要求4所述微孢子虫荧光染色标记方法，其特征在于，所述固定剂为多聚甲醛。6.根据权利要求1所述微孢子虫荧光染色标记方法，其特征在于，所述染色液为染色母液稀释得到的，...

【专利技术属性】
技术研发人员：屈虹男，韩冰，付明，关靖宇，王永亮，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：