一种高通量检测土壤中致病菌污染物迁移的方法技术

本发明专利技术属于环境科学与微生物领域，具体涉及一种高通量检测土壤中致病菌污染物迁移的方法，首先利用GFP绿色荧光蛋白将致病菌标记，再结合流式细胞仪，快速高效地实现致病菌的土壤原位检测。本发明专利技术将分子生物学手段与流式细胞仪结合，利用此类菌株便可以完成快速高通量的精准定量检测，一个样品的检测时间只需要1.5min，一天可以轻松完成几百个样品的检测。一天可以轻松完成几百个样品的检测。一天可以轻松完成几百个样品的检测。

【技术实现步骤摘要】
一种高通量检测土壤中致病菌污染物迁移的方法


[0001]本专利技术属于环境科学与微生物领域，具体涉及一种高通量检测土壤中致病菌污染物迁移的方法。

技术介绍

[0002]土壤致病菌被认为是一种新型生物污染物，如引发农作物病害的青枯菌(Ralstonia solanacearum)和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)等植物致病菌，以及导致人类疾病的结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和破伤风杆菌(Clostridium tetani)等人畜致病菌(朱永官,陈保冬,付伟.土壤生态学研究前沿[J].科技导报,2022,40(03):25
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31)。致病菌污染物在土壤中的运移行为，包括生长、吸附、解吸、沉积(过滤、布朗扩散、截流和沉降)、腐解、钝化和滞留等过程。致病菌污染物在土壤环境富集与传播，是动植物和人类健康的风险因子：一方面致病菌污染物可通过直接接触危及人类健康，另一方面可通过土壤
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植物系统，进入食物链，人类和动物取食被污染的食物，最终引发疾病(Kim,M.
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K.,Kim,S.
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B.&Park,S.
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J.Bacteria transport in an unsaturated porous media:incorporation of air
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water interface area model into transport modelling.Hydrol.Process.22,2370
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2376(2008).)。研究致病菌在土壤中的迁移与扩散，是控制新型生物污染物危害的基本前提，对提升全球一体化(OneHealth)具有重要意义(Wadhwa,N.&Berg,H.C.Bacterial motility:machinery and mechanisms.Nat.Rev.Microbiol.20,161
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173(2022).)。
[0003]当前，检测致病菌污染土壤迁移的方法主要有两类：生物培养法和分子生物学检测法。生物培养法是利用培养基，分离培养土壤样品中的致病菌，通过观察菌落形态、统计细胞数量，来检测污染水平和扩散能力，结果较为可靠(Herigstad,B.,Hamilton,M.&Heersink,J.How to optimize the drop plate method for enumerating bacteria.J.Microbiol.Methods44,121
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129(2001))。然而，生物培养法存在以下问题：1)土壤环境十分复杂，存在着数以万亿的微生物，培养过程中容出现杂菌；2)从配制培养基、到菌落形成，至少一周时间，如果为难培养致病菌，可能时间更长；3)整个过程步骤繁琐复杂，且需在严格灭菌环境下操作，不然极易污染。利用分子生物学的方法进行检测，如荧光定量PCR方法：通过在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成，上游引物用荧光标记，下游引物不标记，在模板扩增的同时，内标也被扩增。在PCR产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。荧光定量PCR方法同样存在着很多问题：1)引物是否存在特异性，微生物之间共享很多基因，非特异性引物可能导致统计结果偏高；2)PCR过程中实验条件的设置需不断重复试错。PCR的温度条件，模板浓度，循环次数等等都需要通过实验进行摸索；3)PCR全部过程十分复杂，需要DNA提取，RNA提取等，且试剂盒价格昂贵，实验成本颇高(Suo,T.et al.ddPCR:a more accurate tool for SARS
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CoV
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2detection in low viral load specimens.Emerg.Microbes Infect.9,1259
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1268
(2020))。上述实验方法均存在诸多缺点，对于研究土壤致病菌在土壤中的迁移过程尚没有很好的方法能快速高效地定量检测样品中微生物的数量。

技术实现思路

[0004]针对现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种高通量检测土壤中致病菌污染物迁移的方法；本专利技术利用GFP绿色荧光蛋白将致病菌进行标记，结合流式细胞仪，快速高效地实现致病菌的土壤原位检测。利用分子生物学手段，将目标土壤致病菌利用分子生物学手段在其染色体基因上通过GFP绿色荧光蛋白进行标记，获得绿色荧光的细菌再进行土壤原位实验，获得的样品结合流式细胞仪可以高通量快速精准的完成致病菌数量的定量检测。
[0005]本专利技术解决其技术问题采用的技术方案是：
[0006]本专利技术首先保护一种高通量检测土壤中致病菌污染物迁移的方法，首先利用GFP绿色荧光蛋白将致病菌标记，再结合流式细胞仪，快速高效地实现致病菌的土壤原位检测。
[0007]光靠流式细胞仪并不能完成致病菌的精准检测，流式细胞仪受限于其光电结构，需要插入对应的荧光蛋白才可以精准检测，本专利技术在利用GFP绿色荧光蛋白将致病菌标记后则可以高通量快速统计样品细菌数量。
[0008]作为本申请的优选技术方案，所述致病菌为青枯菌，更具体的，如青枯菌RS1115。
[0009]作为本申请的一种优选技术方案，所述高通量检测土壤中致病菌污染物迁移的方法，包括如下步骤：
[0010]步骤1，利用荧光标记技术构建GFP绿色荧光青枯菌：
[0011]以GFP基因为模板，设计上下游引物，PCR扩增克隆出目标片段，再通过酶切酶连整合到表达载体上，将表达载体转化感受态青枯菌，筛选出阳性克隆；通过荧光显微镜观察，细菌带有绿色荧光，构建绿色荧光青枯菌完成；
[0012]步骤2，土壤原位取样：将步骤1构建完成的绿色荧光青枯菌作为供试菌株接种在接菌点，至预定时间后，取样；
[0013]步骤3，流式细胞仪检测：将步骤2的样品制成待测样品，利用流式细胞仪检测即可。
[0014]作为本申请的优选技术方案，所述步骤1的上下游引物如SEQ ID No:1
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2所示。
[0015]作为本申请的优选技术方案，所述步骤1的PCR反应体系为：H2O3μl，GC buffer 5μl，DNTP 1μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，PrimeSTAR 0.05μl，DNA 0.5μl。
[0016]作为本申请的优选技术方案，步骤1中，所述表达载体为是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒，病毒载体等，具体可为质粒PUC18。
[0017]在一些具体的实施例中，本专利技术提供了一种步骤3流式细胞仪检测青枯菌的方法：将步骤2取得的样品制成单细胞悬液，用压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高通量检测土壤中致病菌污染物迁移的方法，其特征在于，首先利用GFP绿色荧光蛋白将致病菌标记，再结合流式细胞仪，实现致病菌的土壤原位检测。2.根据权利要求1所述的一种高通量检测土壤中致病菌污染物迁移的方法，其特征在于，所述致病菌为青枯菌。3.根据权利要求1所述的一种高通量检测土壤中致病菌污染物迁移的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1，利用荧光标记技术构建GFP绿色荧光青枯菌：以GFP基因为模板，设计上下游引物，PCR扩增克隆出目标片段，再通过酶切酶连整合到表达载体上，将表达载体转化感受态青枯菌，筛选出阳性克隆；通过荧光显微镜观察，细菌带有绿色荧光，构建绿色荧光青枯菌完成；步骤2，土壤原位取样：将步骤1构建完成的绿色荧光青枯菌作为供试菌株接种在接菌点，至预定时间后，取样；步骤3，流式细胞仪检测：将步骤2的样品制成待测样品，利用流式细胞仪检测即可。4. 根据权利要求3所述的一种高通量检测土壤中致病菌污染物迁移的方法，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：江高飞，于嘉宝，俞胜男，韦中，徐阳春，沈其荣，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：